Wetern Blot蛋白印跡實驗方法及步驟

蛋白免疫印跡法是蛋白質學中常用的檢測方法，Wetern Blot-蛋白印跡實驗步驟

主要是通過SDS凝膠分離、轉印到膜上并進行信號檢測的方法。具體實驗方法如下：
一、試劑和緩沖液

• l 1x RIPA 緩沖液：50 mM Tris、 150 mM NaCl 、0.1% SDS、0.5% 脫氧膽酸鈉、 1% Triton X-100 或 NP40。
• l 1x PBS 緩沖液：137 mM NaCl、2.7 mM KCl 、2.7 mM Na 2 HPO 4、2.7 mM KH 2 PO 4、 pH 7.4
• l BCA 蛋白檢測試劑盒或 Bradford 蛋白檢測試劑盒
• l 1.5 M Tris 緩沖液 (pH 8.8)： 90.68 g Tris-HCl 至 ddH 2 O，使用 HCl 將 pH 調節(jié)至 8.8，最后 500 ml
• l 1.0 M Tris 緩沖液 (pH 6.8)：60.58 g Tris-HCl 至 ddH 2 O，使用 HCl 將 pH 調節(jié)至 6.8，最后 500 ml
• l 10% APS：使用前制備的 1 ml ddH 2 O中的 100 mg AP 。
• l 10% SDS：10 g SDS 在 100 ml ddH 2 O 中。
• l 1x Tris-甘氨酸緩沖液：Tris配比25 mM；  PH=8.3 的甘氨酸配比230 mM、 SDS配比0.1% 。
• l 3x SDS 蛋白上樣緩沖液配制：使用PH=6.8 的 Tris 150 mM 、SDS添加6% 、甘油 添加30% 、 EDTA濃度30 mM 和 溴酚藍 配比0.2% 。緩沖液應隨用隨配、分裝冷凍備用。1x TTBS ： 25 mM Tris（pH 7.5）：0.15 M NaCl 、 0.05% Tween-20、0.001% 硫柳汞
• l 1x 轉移緩沖液：3 g Tris、14.4 g 甘氨酸和 200 ml 甲醇，添加 ddH 2 O 至 1L

二、樣品制備
樣品也可以在一些商業(yè)裂解緩沖液中裂解，例如Thermo Fisher的 Pierce IP 裂解緩沖液 ，而不是 RIPA 緩沖液。

三、細胞培養(yǎng)樣品制備
1. 貼壁細胞

• l 去除上清液并用 1X PBS 洗滌以去除殘留培養(yǎng)基。
• l 添加預冷的 400 ul-1 ml 1X RIPA 緩沖液/100 mm 培養(yǎng)皿。在冰上孵育 5-10 分鐘。
• l 完全刮去細胞并轉移到冰上預冷的 1.5 ml 微管中。
• l （可選）徹底均質化或超聲處理。
• l 4°C 12,000 rpm 離心 10-15 分鐘，收集上清液備用。
• l 總蛋白應儲存在 -20°C 直至需要。 

2. 上清細胞

• l （可選）取出 100 ul 等分試樣進行細胞計數。
• l 將細胞轉移到預冷的 1.5 ml 微管或 15 ml 試管中，并在 4°C 下以 2000 rpm 的速度離心 5 分鐘。
• l 取出培養(yǎng)基，用 1 ml 預冷的 1x PBS 重懸沉淀，然后轉移到 1.5 ml 微管中。
• l 在 4°C 下以 2000 rpm 離心 5 分鐘。
• l 用 1 ml 預冷 RIPA 緩沖液/10 7 個細胞重懸細胞沉淀
• l 將細胞懸液在冰上搖晃 30 分鐘�；驈氐拙�質化/超聲處理。
• l 4°C 12000 rpm 離心 10-15 分鐘，收集上清液備用。
• l 總蛋白應儲存在 -20°C 直至需要。

3.組織制備

• l 組織制備和定量。把它們切成小塊。
• l 添加約 500-600 ul 預冷的 1x RIPA 緩沖液/100 mg 組織。
• l 徹底均勻組織。
• l 在 4°C 下以 12000 rpm 離心 15-20 分鐘。
• l 收集上清液備用。
• l 總蛋白應儲存在 -20°C 直至需要。

 

分離凝膠濃度（%）	蛋白質大小范圍 (kDa)
8	25-200
10	15-100
12.5	10-70
15	12-45
20	4-40

上圖中：蛋白質分離范圍由分辨凝膠濃度決定。Tricine-SDS-PAGE 可用于分離小于 30 kDa 的蛋白質的電泳系統 。

四、蛋白質定量
蛋白印跡實驗步驟中的蛋白定量主要采用Bradford 法和 BCA 法。
1. SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠制備：6%-15% 分離凝膠由頂部的濃縮凝膠 (5%) 和凝膠梳（10 或 15 個孔）制成。

溶解凝膠（10ml）						濃縮凝膠（3ml）
	6%	8%	10%	12%	15%
H 2 0	5.3	4.6	4.0	3.3	2.3	2.1
30% 丙烯酰胺混合物*	2.0	2.7	3.3	4.0	5.0	0.5
1.5M Tris（pH 8.8）	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5	1.0M Tris (pH 6.8) 0.38
10% SDS	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.03
10% APS	0.1	0.1	0.1	.1	0.1	0.03
TEMED	0.008	0.006	0.004	0.004	0.004	0.003

五、上樣和電泳
l 將 2X SDS 蛋白質上樣緩沖液與蛋白質樣品以 1:1 的比例混合。樣品預熱到 50-60°C。進行預染。

六、蛋白質轉移
將蛋白質轉移到 PVDF 或 NC 膜上進行抗體檢測。

• l 在 1X 轉印緩沖液中預潤濕凝膠、Whatman 紙和海綿等材料。
• l PVDF 膜應在甲醇中孵育 10 秒。至 1 分鐘，然后移至 1X 轉移緩沖液。
• l 將以下材料堆疊：外殼（黑色面）、海綿、Whatman 紙、凝膠、膜、Whatman 紙、海綿、外殼（透明面）。
• l 將黑色面朝黑色放入轉印設備中。
• l 在低溫環(huán)境中，使用轉印緩沖液進行轉印操作。轉印電流和時間可以根據實驗過程和使用說明進行優(yōu)化。

七、抗體孵育

• l 一抗在 1X TBST+3% BSA 中以推薦的稀釋度稀釋或根據結果優(yōu)化稀釋度。
• l 在 4°C 下孵育過夜或更長時間，或在室溫下孵育 4 小時。
• l 回收一抗并儲存在 4°C。然后在 RT 的振動篩上洗滌膜 3X 5-10 分鐘。
• l 在 1X TBST 中稀釋二抗并將膜在室溫下孵育 1 小時或在振蕩器上在 4°C 下孵育 2-4 小時。
• l 在 RT 的搖床上用 TBST 洗滌 3X 10 分鐘。

ECL+ 系統和 X 射線膠片用于 HRP 標記的二抗。