攻克甜蜜負(fù)擔(dān)，盤點(diǎn)糖尿病研究常用的動物模型

糖尿病作為一種慢性代謝性疾病，通常不會在患者身上獨(dú)立存在，而常與其他諸多非健康狀態(tài)或疾病并存，在這個數(shù)病齊發(fā)的過程中糖尿病往往是“開路先鋒”，據(jù)統(tǒng)計全球高達(dá)4億多人飽受糖尿病困擾，其中我國糖尿病患病人數(shù)居全球之首，已超1.3 億。為了解決糖尿病這個“甜蜜負(fù)擔(dān)”，我們需要探究糖尿病的發(fā)病機(jī)制，針對每一類糖尿病構(gòu)建合適的動物模型，開發(fā)對癥的藥物。今天，小編就為大家介紹一下糖尿病研究常用的模型。
 

圖1.全球糖尿病患者統(tǒng)計

01糖尿病簡介
糖尿病是以高血糖為特征的慢性代謝性疾病，且難以治愈一般需要終生服藥。糖尿病的可怕在于其會導(dǎo)致眼、腎、心臟、血管、神經(jīng)等組織器官的慢性損傷和功能障礙，并有概率引起各種并發(fā)癥，如失明、腎衰竭、心臟病、中風(fēng)和下肢截癱等。據(jù)《中國2型糖尿病防治指南（2020版）》指出，我國糖尿病患病率已上升至11.2%，也就是說我國每10個成年人就有1個糖尿病患者，這對個人和社會都是沉重的負(fù)擔(dān)[1]。
 

圖2.糖尿病并發(fā)癥

臨床上對于糖尿病的病因分型，目前應(yīng)用最為廣泛、大體上最被公認(rèn)是1999年世界衛(wèi)生組織（WHO）公布的這4類，即1型糖尿病（T1DM）、2型糖尿病（T2DM）、特殊類型糖尿病和妊娠期糖尿�。℅DM）。2019年WHO又在此基礎(chǔ)上，將成人隱匿性自身免疫糖尿�。↙ADA）和酮癥傾向T2DM歸類為“混合型糖尿病”，且添加了“未分類糖尿病”，從而將糖尿病分為6種類型[5]。每種類型糖尿病的特征如下：

• T2DM是糖尿病患者中最主要的群體，其主要發(fā)病原因是胰島素抵抗及胰島素分泌相對不足。

• T1DM是由于胰島β細(xì)胞破壞、胰島素分泌缺乏所致，特征是胰島功能差，終身需要依賴胰島素治療。

• 繼發(fā)性糖尿病是一類由特定疾病或藥物等相關(guān)因素引起血糖升高的糖尿病類型。

• GDM是指與妊娠狀態(tài)相關(guān)的糖代謝異常，但未達(dá)到非孕人群糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)，GDM患者糖代謝多數(shù)于產(chǎn)后能恢復(fù)正常，但將來患II型糖尿病概率也會增加。

• 單基因糖尿病由影響胰島β細(xì)胞發(fā)育、功能或胰島素作用的單個基因突變所致，約占所有糖尿病的1%~5%，迄今已發(fā)現(xiàn)70余個單基因糖尿病的致病基因，大多數(shù)通過影響胰島β細(xì)胞功能而致血糖異常。

• 未定型糖尿病指部分糖尿病患者表現(xiàn)不典型，根據(jù)其癥狀、體征和已經(jīng)完成前述的胰島功能、胰島自身抗體及基因檢測等結(jié)果仍不能分型者。

目前，市面上已有多款治療不同糖尿病的藥物，這些藥物有效改善了眾多糖尿病患者的生活質(zhì)量，但現(xiàn)有的治療策略無法阻止糖尿病的進(jìn)展和慢性并發(fā)癥的發(fā)生，且大部分藥物針對的都是最常見的T2DM和T1DM，其他類型的糖尿病人缺乏足夠的治療手段。因此，糖尿病的研究依然任重道遠(yuǎn)。

02 糖尿病動物模型
糖尿病實驗動物模型作為重要的科研工具，在糖尿病機(jī)理研究，藥物篩選以及藥物臨床前實驗都發(fā)揮了重要作用。目前，隨著生物醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，糖尿病動物模型造模所用的實驗動物種類和造模手段日呈多元化發(fā)展，糖尿病動物模型的構(gòu)建也能更好地模擬人類糖尿病的發(fā)生發(fā)展。針對不同因素導(dǎo)致的糖尿病，研究人員應(yīng)選擇與之研究主體相接近的糖尿病模型作為研究對象。小編在此歸納總結(jié)了當(dāng)前糖尿病研究的主要嚙齒類模型，以饗讀者。
 

圖3.小鼠模型

 

 2.1   自發(fā)性糖尿病模型
自發(fā)性糖尿病動物模型是指在自然條件下，未經(jīng)過人工處理而發(fā)生糖尿病的實驗動物，且其后代仍大概率患糖尿病。常見的自發(fā)性糖尿病有NOD小鼠、ob/ob小鼠、db/db小鼠、BB大鼠、LETL大鼠等。自發(fā)性模型動物糖尿病的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程與人類的糖尿病相似，在糖尿病研究上應(yīng)用廣泛，常用自發(fā)性糖尿病大小鼠模型如下表所示。

 2.2   誘發(fā)性糖尿病模型
化學(xué)藥物誘導(dǎo)：已發(fā)現(xiàn)多種化合物可在動物模型誘發(fā)糖尿病，其中鏈脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)和四氧嘧啶(Alloxan,ALX)是最常用的，這兩種藥物都是細(xì)胞毒性葡萄糖類似物，對GLUT2轉(zhuǎn)運(yùn)體具有高度親和力，主要破壞胰島β細(xì)胞[2]。比起ALX，STX因其具有更好的穩(wěn)定性和更小的毒性而更受歡迎。若在大小鼠懷孕期間，進(jìn)行STZ誘導(dǎo)則可以構(gòu)建GDM模型。但這種方法存在一定的風(fēng)險，可能導(dǎo)致孕鼠流產(chǎn)，且STZ對胰島的破壞是不可逆的，而一般GDM患者血糖在產(chǎn)后能恢復(fù)正常，因此實驗動物可以在產(chǎn)后再移植一個正常的胰島，但是這個手術(shù)難度高且成本不菲。
 

圖4.STZ破壞胰島β細(xì)胞原理圖[6]

飲食誘導(dǎo)（DIO）：飲食誘導(dǎo)的動物糖尿病模型與人類糖尿病相似，常用來研究飲食、基因等因素與肥胖/糖尿病等疾病進(jìn)程之間的關(guān)系。例如C57BL/6小鼠持續(xù)高脂飲食飼喂14周左右，檢測糖尿病相關(guān)指標(biāo)，這類模型可用于肥胖、II型糖尿病研究。
 

圖5.DIO肥胖小鼠

手術(shù)誘導(dǎo)：直接全部或大部分切除實驗動物的胰腺，如果連續(xù)兩天血糖值超11.1mmol/L或者葡萄糖耐量試驗120min時的血糖值仍未恢復(fù)到注射前水平則認(rèn)為DM造模成功。該技術(shù)必需經(jīng)過專門技術(shù)訓(xùn)練且需配套的手術(shù)設(shè)備，還需消除外分泌胰腺消化酶和其他胰島激素的混雜效應(yīng)的影響，因此其廣泛應(yīng)用受到限制[4]。

 
2.3   基因修飾糖尿病模型
利用基因修飾技術(shù)對特定DNA片段進(jìn)行定點(diǎn)敲除、敲入以及替換來實現(xiàn)基因表達(dá)的上調(diào)或下調(diào)，從而構(gòu)建相關(guān)基因型的糖尿病動物模型。這類模型可以穩(wěn)定遺傳，有利于研究糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制，并可用于糖尿病藥物的篩選和藥理藥效研究。

Ins2-C96Y點(diǎn)突變小鼠
研究發(fā)現(xiàn)若小鼠胰島素A鏈中的第七個氨基酸Cys96（TGC）變?yōu)門yr（TAC），會導(dǎo)致胰島素A鏈和B鏈之間的一個關(guān)鍵二硫鍵無法形成，從而導(dǎo)致小鼠proinsulin-2蛋白的錯誤折疊這些錯誤折疊的蛋白的積累最終會導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和胰島β細(xì)胞凋亡[3]。這個突變是Akita小鼠自發(fā)糖尿病的原因，據(jù)此我們構(gòu)建了Ins2-C96Y點(diǎn)突變小鼠模型，并觀察到從4周齡開始，Ins2-C96Y雜合子小鼠就表現(xiàn)出多食、多飲、高血糖、體重不增的明顯糖尿病癥狀，且癥狀隨著年齡增長而加重，上述研究結(jié)果表明Ins2-C96Y小鼠可作為I型糖尿病研究的動物模型。

Ins2-C96Y的詳細(xì)介紹可以移步我們往期推文：
疾病小鼠模型系列之I型糖尿病篇（上）

圖6.Akita小鼠發(fā)病基本原理

胰腺特異性敲除PRLR小鼠
孕鼠STZ誘導(dǎo)構(gòu)建GDM模型的難度較高，因此有研究者嘗試構(gòu)建基因修飾的GDM模型。2019年，NteebaJ等構(gòu)建了PRLR-flox小鼠，催乳素受體（PRLR）是孕期維持體內(nèi)血糖穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵分子，敲除PRLR基因能導(dǎo)致妊娠期β細(xì)胞不能正常擴(kuò)增，體內(nèi)葡萄糖穩(wěn)態(tài)受損。將PRLR-flox小鼠和pdx1-Cre（胰島特異性Cre工具鼠）交配，得到的陽性子代在懷孕時能成功觀察到GDM的表型[10]。

GK/IRS-1雙基因敲除小鼠
IRS-1-/-小鼠表現(xiàn)為胰島素抵抗，但由于β細(xì)胞代償性增生，胰島素分泌增多，糖耐量正常。β細(xì)胞特異GK表達(dá)降低的小鼠，顯示輕度糖耐量異常。兩者雜交產(chǎn)生的GK/IRS-1雙基因剔除小鼠，表現(xiàn)Ⅱ型糖尿病癥狀，既有胰島素抵抗又有糖耐量異常。

Gck敲除/Hnf4a敲除/Abcc8敲除等模型
Gck、Hnf4a、Abcc8等基因與胰島β細(xì)胞發(fā)育、功能或胰島素信號通路有關(guān)，這些由基因突變導(dǎo)致的糖尿病統(tǒng)稱為單基因糖尿病。它們的臨床癥狀與T2DM和T1DM類似，常被誤診，導(dǎo)致患者得不到正確的治療。
· 葡糖激酶基因（Gck）被稱為“葡萄糖感受器”，不僅是糖代謝過程中關(guān)鍵的限速酶，在β細(xì)胞中它還可以通過感受血糖水平調(diào)節(jié)胰島素的分泌。Gck突變會導(dǎo)致輕度空腹血糖升高和輕度胰島分泌功能異常[9]。

· Hnf4a主要表達(dá)于肝臟，但在胰腺和腎臟上也有表達(dá)，該基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子通過多種途徑影響糖代謝，Hnf4a突變會導(dǎo)致高胰島素血癥和巨大兒的癥狀[10]。

· Abcc8基因編碼在胰島素分泌中起重要作用的KATP通道的SUR1調(diào)節(jié)亞單位，其突變可影響鉀離子通道關(guān)閉和β細(xì)胞膜的去極化、抑制胰島素分泌，導(dǎo)致常染色體顯性遺傳性糖尿病[11]。

構(gòu)建上述關(guān)鍵基因的敲除模型和條件性敲除模型，可用于單基因糖尿的機(jī)制研究，是提高單基因糖尿病個體化精準(zhǔn)診治水平的關(guān)鍵。

GLP-1R人源化模型
胰高血糖素樣肽-1受體（glucagon-like peptide-1 receptor, GLP-1R）廣泛分布在胰島、胃、小腸、心臟、腎臟、肺、大腦等組織器官中， 當(dāng)它被GLP-1或人工合成的GLP-1R激動劑激活后，便能發(fā)揮多種不同的生理功能。GLP-1R的主要作用是和胰高血糖素樣肽-1結(jié)合，調(diào)節(jié)血糖，它是治療2型糖尿病最有效的靶點(diǎn)之一[8]。如果能在小鼠上敲入人源的GLP-1R基因，讓小鼠表達(dá)人源GLP-1R，就可以直接使用小鼠來篩選糖尿病藥物，并初步分析候選藥物的藥理藥效，把曾經(jīng)要到志愿者身上才能驗證的一些藥物性能提前到小鼠上實現(xiàn)，可以大大節(jié)約藥物開發(fā)的成本和時間。

關(guān)于GLP-1R人源化模型的詳細(xì)介紹可以查閱我們的往期推文：
GLP-1R丨2型糖尿病治療的明星靶點(diǎn)

 

圖7.GLP-1R的生理功能

 

03 優(yōu)吉鼠庫糖尿病動物模型
南模生物優(yōu)吉鼠模型資源庫含多種自主構(gòu)建的基因修飾糖尿病研究模型，可用于糖尿病的基礎(chǔ)研究和藥物開發(fā)，詳細(xì)模型信息見下表：

*：疾病預(yù)測數(shù)據(jù)是基于已發(fā)表文獻(xiàn)中的近似模型 （與公司模型具有相似的構(gòu)建策略或基因型）預(yù)測獲得。

南模生物深耕基因編輯領(lǐng)域，提供全方位模式生物服務(wù)，包括基因修飾成品模型供應(yīng)、個性化模型定制、飼養(yǎng)繁育、表型分析、藥效評價等，滿足不同實驗室需求。

參考文獻(xiàn)：

[1]中國2型糖尿病防治指南（2020版）

[2]KachapatiK,AdamsD,BednarK,etal.Thenon-obesediabetic(NOD)mouseasamodelofhumantype1diabetes.MethodsMolBiol.2012;933:3-16.
 
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[4]KleinertM,ClemmensenC,HofmannSM,etal.Animalmodelsofobesityanddiabetesmellitus.
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[5]https://www.who.int/zh/news-room/fact-sheets/detail/diabetes
 
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