檢測細胞凋亡的方法分類及介紹

   

在細胞的“花樣”死亡方式一文中，小 M 已經(jīng)介紹過細胞的死亡方式有十幾種，凋亡只是其中一種：細胞凋亡 (Apoptosis)，又稱程序性細胞死亡，是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細胞自主有序的死亡。

 

與被動的細胞壞死不同，細胞凋亡是主動發(fā)生的，是為更好地適應(yīng)生存環(huán)境而主動爭取的一種死亡過程，期間涉及一系列基因的激活、表達以及調(diào)控等。

圖 1. 細胞凋亡的信號通路^[1]

 

細胞凋亡的主要形態(tài)學(xué)特征包括：染色質(zhì)固縮、DNA 片段化、細胞膜起泡、細胞皺縮、凋亡小體的形成等。

圖 2. 細胞凋亡過程

 
   
 
細胞凋亡，我們該如何檢測呢?
目前至少有數(shù)十種檢測細胞凋亡的方法，可以大致劃分為基于細胞形態(tài)、生物學(xué)功能和生化標記三大類。

 

■ 基于細胞形態(tài)學(xué)的方法

 
1.1 電子顯微鏡檢測
電鏡形態(tài)學(xué)觀察是迄今為止判斷凋亡最經(jīng)典、最可靠的方法，被認為是確定細胞凋亡的金標準。細胞凋亡的主要形態(tài)學(xué)特征包括：染色質(zhì)固縮、DNA 片段化、細胞膜起泡、細胞皺縮、凋亡小體的形成等。
 

 
1.2 細胞核染色檢測
細胞凋亡時，細胞膜通透性增強，染色質(zhì)發(fā)生固縮，故經(jīng) DAPI、Hoechst 系列等熒光染料染色后可快速檢測細胞凋亡。除了實驗操作簡單、成本低廉之外，細胞核染色還可以定量。
 

圖 4. PC-3 細胞凋亡過程中核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)變化^[3]

注：Hoechst 33342 染色觀察到核碎裂和核凝結(jié)。用 0、0.3、0.6、0.9 和 1.2 mg/mL 的莖提取物處理 PC-3 細胞 24h 后，細胞出現(xiàn)典型的凋亡細胞核形態(tài)變化。照片在 20× 熒光顯微鏡下拍攝。箭頭表示凋亡細胞。

 

■ 基于生物學(xué)功能的方法

 

2.1 線粒體膜電位的檢測
凋亡早期細胞，線粒體膜通透性增加，線粒體膜電位 (ΔΨm) 下降甚至消失。線粒體膜電位的下降被認為是細胞凋亡過程中最早發(fā)生的生物學(xué)變化。一旦線粒體膜電位被破壞，細胞凋亡將不可逆轉(zhuǎn)。
 
目前常用一些親脂性陽離子染料如 JC-1 (HY-K0601) 檢測線粒體膜電位的變化。線粒體膜電位較高時，JC-1 在基質(zhì)中匯聚形成聚合物，可以產(chǎn)生紅色熒光 (Ex/Em=585/590 nm)；線粒體膜電位較低時，JC-1 不能聚集在線粒體基質(zhì)中，以單體形式存在產(chǎn)生綠色熒光 (Ex/Em=510/527 nm)。
 

 

2.2 細胞膜表面磷脂酰絲氨酸 (PS) 的檢測
在正常細胞中，磷脂酰絲氨酸 (PS) 位于細胞膜內(nèi)側(cè)；細胞凋亡早期，PS 會外翻到細胞膜外側(cè)。Annexin V (膜聯(lián)蛋白 V) 是一種 Ca²⁺ 依賴性磷脂結(jié)合蛋白，可與 PS 特異性結(jié)合，因此 Annexin V 常作為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標之一。Annexin V 經(jīng) FITC 標記后可發(fā)綠色熒光。碘化丙啶 (Propidium Iodide, PI) 染色液是一種不能穿透細胞膜的紅色熒光染料，可對凋亡晚期細胞及壞死細胞染色。
 
經(jīng) Annexin V-FITC 和 PI 聯(lián)合染色后，正常細胞基本無熒光 (Annexin V^-/PI^-)，早期凋亡細胞呈綠色熒光 (Annexin V⁺/PI^-)，晚期凋亡細胞及壞死細胞則呈綠色和紅色熒光 (Annexin V⁺/PI⁺)。
 

 
此外，除了用 FITC 標記 Annexin V 之外，也可以用 EGFP、PE、mCherry 等作為熒光探針哦。

 

■ 基于生化標記的方法

 

3.1 凋亡分子標記檢測

Caspase (cysteinyl-aspartic acid proteases) 蛋白家族在介導(dǎo)細胞凋亡過程中具有重要的作用。絕大多數(shù)情況下，所有的凋亡信號都會匯集到凋亡的最終執(zhí)行者 Caspase-3 上。在正常細胞中，Caspase-3 以酶原形式存在，在凋亡早期 Caspase-3 被激活，并執(zhí)行最后的凋亡程序。因此可以通過檢測 Caspase 3 剪切體的含量或 Caspase 3 的活性來反應(yīng)細胞凋亡過程。此外，也可以通過檢測 Caspase-3 的底物——PARP 蛋白的含量來檢測細胞凋亡。

 

圖 7. ZnO-NPs 誘導(dǎo)牙齦癌細胞的凋亡情況^[6]

 

3.2 DNA 片段化檢測

在細胞凋亡的后期，Caspase 會激活 Caspase-Activated DNase (CAD)，切割核小體之間的 DNA，形成以 180-200 bp 為單位的 DNA 片段，經(jīng)瓊脂糖電泳后形成 DNA ladder。

 

圖 8. DNA 片段化檢測 MCP30 誘導(dǎo)下 Ishikawa H 細胞的凋亡情況^[7]

注：泳道 1-4 分別表示 0 pM、8.33 pM、333.33 pM 和 666.67 pM MCP30 誘導(dǎo) 72h 的 Ishikawa H 細胞

 

3.3 DNA 片段原位檢測 (TUNEL 法)

細胞凋亡時，相關(guān) DNA 內(nèi)切酶被激活，進而切斷核小體間的基因組 DNA，產(chǎn)生 180-200 bp 的 DNA ladder，暴露的 3’-OH 在末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶 (Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT) 的催化下加上特異熒光探針標記的 dUTP，借助熒光顯微鏡或流式細胞儀即可檢測細胞凋亡的發(fā)生。

 

 

看了這么多，相信大家對細胞凋亡的檢測方法都有了大概的了解。MCE 現(xiàn)已推出細胞凋亡檢測相關(guān)試劑盒，心動不如行動，來 MCE 官網(wǎng)查詢具體的產(chǎn)品信息吧！

 

相關(guān)產(chǎn)品

細胞凋亡與壞死檢測試劑盒 采用 Hoechst 33342 和碘化丙啶 (Propidium Iodide, PI) 雙染的方法快速檢測細胞凋亡與細胞壞死。

細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒 采用碘化丙啶 (Propidium Iodide, PI) 染色的方法檢測細胞周期和細胞凋亡。

細胞凋亡檢測試劑盒 (Hoechst 法) 采用 Hoechst 33258 染色的方法快速檢測細胞凋亡。

Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒 經(jīng) Annexin V-FITC 和 PI 聯(lián)合染色后，正常細胞基本無熒光 (Annexin V-/PI-)，早期凋亡細胞呈綠色熒光 (Annexin V+/PI-)，晚期凋亡細胞及壞死細胞則呈綠色和紅色熒光 (Annexin V+/PI+)。

Annexin V-EGFP/PI 細胞凋亡檢測試劑盒 Annexin V-EGFP 和 PI 聯(lián)合染色后，正常細胞基本無熒光 (Annexin V-/PI-)，早期凋亡細胞呈綠色熒光 (Annexin V+/PI-)，晚期凋亡細胞及壞死細胞則呈綠色和紅色熒光 (Annexin V+/PI+)。與 FITC 相比，EGFP 的綠色熒光更強，不易淬滅，穩(wěn)定性更高。

線粒體膜電位檢測試劑盒 (JC-1) 一種以 JC-1 為熒光探針，快速靈敏地檢測組織、細胞或純化的線粒體跨膜電勢差的試劑盒，可以用于早期的細胞凋亡檢測。

MCE 的所有產(chǎn)品僅用作科學(xué)研究或藥證申報，我們不為任何個人用途提供產(chǎn)品和服務(wù)。

 

 

參考文獻

1. Wu J, Ye J, Kong W, et al. Programmed cell death pathways in hearing loss: A review of apoptosis, autophagy and programmed necrosis. Cell Prolif. 2020, 53(11): e12915.

2. Liu L, Fan J, Ai G, et al. Berberine in combination with cisplatin induces necroptosis and apoptosis in ovarian cancer cells. Biol Res. 2019, 52(1): 37.
3. Chainumnim S, Saenkham A, Dolsophon K, et al. Stem Extract from Momordica cochinchinensis Induces Apoptosis in Chemoresistant Human Prostate Cancer Cells (PC-3). Molecules. 2022, 27(4): 1313.
4. Xu K, Park D, Magis AT, et al. Small Molecule KRAS Agonist for Mutant KRAS Cancer Therapy. Mol Cancer. 2019, 18(1): 85.
5. Liu W, Liu X, Pan Z, et al. Ailanthone Induces Cell Cycle Arrest and Apoptosis in Melanoma B16 and A375 Cells. Biomolecules. 2019, 9(7): 275.
6. L SW, Lee CH, Lin MS, et al. ZnO Nanoparticles Induced Caspase-Dependent Apoptosis in Gingival Squamous Cell Carcinoma through Mitochondrial Dysfunction and p70S6K Signaling Pathway. Int J Mol Sci. 2020, 21(5): 1612.
7. Gu HZ, Lin RR, Wang HC, et al. Effect of Momordica charantia protein on proliferation, apoptosis and the AKT signal transduction pathway in the human endometrial carcinoma Ishikawa H cell line in vitro. Oncol Lett. 2017, 13(5): 3032-3038.

8. Wei R, Cao J, Yao S. Matrine promotes liver cancer cell apoptosis by inhibiting mitophagy and PINK1/Parkin pathways. Cell Stress Chaperones. 2018, 23(6): 1295-1309.