不孕不育的相關(guān)因素和動物模型在促進(jìn)相關(guān)機(jī)制研究和藥物研發(fā)中的應(yīng)用

根據(jù)中國人口協(xié)會、國家衛(wèi)健委發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，中國育齡夫婦的不孕不育率從20年前的2.5%~3%攀升到近年的12%-15%左右，不孕不育者約有5000萬人。據(jù)相關(guān)機(jī)構(gòu)預(yù)測，到2023年，中國育齡人群整體不孕不育率將會達(dá)到18.2%，育齡人群的生育狀況不容樂觀，本文總結(jié)了影響不孕不育的相關(guān)因素和相關(guān)動物模型，以期促進(jìn)不孕不育的機(jī)制研究和藥物研發(fā)。

圖1 不孕不育的發(fā)生率^[1]

01生殖系統(tǒng)簡介
1.1   男性生殖系統(tǒng)
男性生殖系統(tǒng)包括外部生殖結(jié)構(gòu)和內(nèi)部生殖結(jié)構(gòu)，外部部分包括陰莖、陰囊和睪丸。其中睪丸通常位于陰囊中，由眾多的生精小管構(gòu)成，是精子發(fā)生的部位。生精小管間具有間質(zhì)細(xì)胞，能分泌雄性激素促進(jìn)生殖器官發(fā)育、成熟和第二性征的形成及維持。生精小管經(jīng)輸出小管到達(dá)附睪。

附睪是大而卷曲的管，精子在這里經(jīng)過重要發(fā)育階段而成熟。附睪下端經(jīng)輸精管而達(dá)于尿道。精液經(jīng)尿道、陰莖而通體外。男性的內(nèi)部生殖器官包括輸精管、射精管、尿道、精囊、前列腺和尿道球腺。精囊腺、前列腺和尿道球腺是重要的附屬腺體，它們的分泌物構(gòu)成精液的主體，所含的營養(yǎng)物質(zhì)，能促進(jìn)精子的活性。
 

圖2 男性生殖系統(tǒng)^[2]

精子發(fā)生是男性執(zhí)行生育功能的關(guān)鍵事件之一，成熟精原干細(xì)胞在睪丸微環(huán)境中通過一系列發(fā)育過程分化為成熟精子。睪丸組織中的體細(xì)胞微環(huán)境主要由支持細(xì)胞（Sertoli cell）、間質(zhì)細(xì)胞（leydig cell）、管周肌樣細(xì)胞（myoid cells）和睪丸巨噬細(xì)胞（macropahge）共同形成^[3]。

支持細(xì)胞是生精小管的上皮支持細(xì)胞，呈高大的柱狀，從基底膜延伸到管腔，它們圍繞著增殖和分化的生殖細(xì)胞。主要功能是為精子提供毛細(xì)血管來源的營養(yǎng)，形成血-睪丸屏障，產(chǎn)生有助于精細(xì)胞成熟的睪丸液。間質(zhì)細(xì)胞位于生精小管之間，細(xì)胞質(zhì)中含有許多膽固醇脂滴。間質(zhì)細(xì)胞制造和分泌睪酮，進(jìn)而促進(jìn)精子的產(chǎn)生、附屬性腺的分泌和男性次要特征的獲得。管周肌樣細(xì)胞是鱗狀可收縮的細(xì)胞，可促進(jìn)精子的運輸。睪丸巨噬細(xì)胞能夠促進(jìn)精原細(xì)胞的維持，并阻礙其它免疫系統(tǒng)物質(zhì)進(jìn)入睪丸組織。
 

圖3 生精小管和小管外間質(zhì)組織中的細(xì)胞^[4]

 1.2   女性生殖系統(tǒng)
女性生殖系統(tǒng)也包括外部生殖結(jié)構(gòu)和內(nèi)部生殖結(jié)構(gòu)，外部生殖結(jié)構(gòu)包括陰阜、大陰唇、小陰唇、陰蒂、陰道前庭，內(nèi)部生殖結(jié)構(gòu)包括陰道、子宮、輸卵管及卵巢。卵巢是卵子發(fā)生的部位，存在數(shù)量眾多的處于不同發(fā)育階段的濾泡。每個濾泡內(nèi)含有一個卵細(xì)胞，濾泡液含有雌性激素，能促進(jìn)生殖管道、乳房的發(fā)育以及第二性征的成熟。卵子成熟后，濾泡破裂，卵及濾泡液一起排出。所殘余的濾泡即逐漸縮小，并由一種黃色細(xì)胞所充滿，成為黃體。成熟卵排出后，進(jìn)入輸卵管前端的開口（輸卵管傘），沿輸卵管下行達(dá)于子宮，受精作用發(fā)生于輸卵管上段。已受精的卵將植于子宮內(nèi)壁上，在這里接受母體營養(yǎng)而發(fā)育。
 

圖4 女性生殖系統(tǒng)^[5]

卵巢是雌性執(zhí)行生殖功能的主要器官，卵巢中有五種主要的細(xì)胞類型：顆粒細(xì)胞（GC），卵泡膜細(xì)胞（TC）和基質(zhì)細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞^[6]。

卵巢顆粒細(xì)胞是卵巢的主要功能細(xì)胞，其增殖與分化直接影響著卵泡的生長啟動、發(fā)育、排卵、黃體形成以及甾體激素分泌等卵巢功能活動。卵泡發(fā)育的顯著標(biāo)志之一就是顆粒細(xì)胞迅速生長及增殖，而成年動物的卵泡閉鎖主要是由顆粒細(xì)胞凋亡引起，尤其在卵泡發(fā)育后期，此外，顆粒細(xì)胞還與卵泡膜細(xì)胞共同完成卵巢激素的合成，維持著有利于卵母細(xì)胞生長和成熟的微環(huán)境。

卵泡外膜則由一層或多層平滑肌細(xì)胞構(gòu)成，接受自主神經(jīng)支配，促使其收縮，其精確作用尚不清楚，但平滑肌細(xì)胞的收縮與排卵及卵泡閉鎖有關(guān)。卵巢的血管重塑支持著濾泡生長和變性，內(nèi)皮細(xì)胞參與血管重塑過程。卵巢含有多種免疫細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞、粒細(xì)胞等，可分泌可溶性調(diào)節(jié)因子，單獨或聯(lián)合調(diào)節(jié)卵泡發(fā)生、排卵和黃體形成。
 

圖5 卵泡成熟過程

南模生物在小鼠生殖系統(tǒng)特定細(xì)胞類群marker基因中敲入Cre/Dre 等重組酶元件，可以在特定細(xì)胞群里進(jìn)行基因及細(xì)胞功能的研究。具體模型信息見下表：

 

02影響不孕不育的遺傳因素
男性的不育最常由精子發(fā)生障礙引起，臨床上稱為少精子癥或無精子癥。男性不育致病因素復(fù)雜（見圖6），目前已知的主要因素包括遺傳因素、抗精子抗體、感染、內(nèi)分泌因素、疾病、鋅缺乏、環(huán)境、飲食和吸煙等。在少精子癥、弱精子癥及非梗阻性無精子癥發(fā)生的因素中，遺傳因素占到了大約30%，其中包括基因突變和染色體異常^[7]。
 

圖6 男性不育相關(guān)因素致病過程模式圖^[7]

X、Y染色體作為決定性別發(fā)育的重要染色體，其結(jié)構(gòu)、數(shù)量變化及其基因仍是學(xué)術(shù)界研究男性不育的重點。例如，Y染色體上存在的精子發(fā)生相關(guān)基因——無精子因子（AZF）區(qū)，是最常見的染色體微缺失區(qū)域。相關(guān)基因則有無精子缺失基因（DAZ）、RNA結(jié)合基序基因（RBMY）、USP9Y基因。X染色上的關(guān)鍵基因則有雄激素受體（AR）、Anos1、Rhox及USP26等。此外，位于常染色體上的CFTR基因純合子突變會引起男性先天性雙側(cè)輸精管缺失，導(dǎo)致阻塞性無精子癥。其它關(guān)鍵基因還有INSL3-RNFP2、SYCP3、KLHL10、AURKC等。線粒體DNA的缺失也對男性生育有一定的影響^[7]。

對于女性而言，引起不孕癥的因素以生殖系統(tǒng)相關(guān)病變居多，主要為子宮病變和卵巢病變，此外機(jī)體免疫功能異常（即產(chǎn)生致病性抗體如抗精子抗體、抗卵巢抗體等）及社會-心理-精神因素對不孕癥也有明顯影響^[8]。近來發(fā)現(xiàn)，單基因變異與女性不育也有一定的關(guān)系。
 

圖7 2015年我國女性不孕的主要原因構(gòu)成^[9]

46,XY性腺發(fā)育不全又稱之為Swyer綜合征，主要與參與性別決定過程中的基因突變有關(guān)，例如NR5A1，MAP3K1，GATA4，F(xiàn)OG2基因突變。NR5A1編碼的轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)控性腺發(fā)育和生殖相關(guān)的基因表達(dá)，該基因突變后將導(dǎo)致性腺發(fā)育不全。SRY基因一直被認(rèn)為是性腺發(fā)育途徑中的關(guān)鍵基因，約有15%的46,XY 患者攜帶SRY基因突變。最近發(fā)現(xiàn)DHX37基因也與性腺發(fā)育不全有關(guān)。

此外，BMP15在卵巢早衰病中起到?jīng)Q定性的作用，缺失突變后在純合狀態(tài)下引起卵巢功能不全。NOBOX、FLGLA、EIF4ENIF也與卵巢早衰病有關(guān)。LHCGR、ZP基因則與空卵泡綜合征有關(guān)^[10]。

03 不孕不育小鼠模型
目前不孕不育的臨床治療主要依靠輔助生殖技術(shù)，但其存在費用高、操作繁瑣以及高多胎率等一系列亟待解決的問題。因此，研究不孕不育的發(fā)病機(jī)制并針對病因給予治療是今后的主要研究方向。通過構(gòu)建不孕不育小鼠模型，將有助于疾病機(jī)制的研究和臨床治療。

 3.1   雄性不育小鼠模型^[11]
雄性不育小鼠模型可以通過物理方法（例如，熱刺激、輻射效應(yīng)）、化學(xué)方法（例如，化療藥物誘導(dǎo)）、手術(shù)方法（實驗性隱睪、手術(shù)致精索靜脈曲張）以及基因敲除的方法構(gòu)建。這里主要介紹下基因敲除小鼠模型。Xrcc1是一種重要的DNA修復(fù)基因，在精子發(fā)生早期高度表達(dá)。Xrcc1基因敲除小鼠與野生型小鼠比較，睪丸體積更小、精子活性減弱、生精小管數(shù)量減少，且誘導(dǎo)睪丸活性氧水平升高，損害精子和精原干細(xì)胞。雄激素和雄激素受體（AR）促使睪丸發(fā)揮正常生理功能。AR敲除小鼠生殖細(xì)胞發(fā)育不完整，導(dǎo)致無精子癥及不育。MIWI蛋白是RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）的核心元件-Argonaute蛋白家族成員之一，敲除Miwi后，會造成小鼠精子產(chǎn)生明顯缺陷，表現(xiàn)為雄性不育。

3.2   雌性不育小鼠模型
雌性不育的疾病類型較多，本文著重總結(jié)了人群中多發(fā)的多囊卵巢綜合征和卵巢早衰相關(guān)小鼠模型。

• 多囊卵巢綜合征小鼠模型^[12]

多囊卵巢綜合征（PCOS）是女性不孕不育的主要原因之一。在過去幾十年里，PCOS的動物模型主要由人工誘導(dǎo)而成，例如雄激素誘導(dǎo)和高脂飲食。有研究者認(rèn)為，不同基因背景的小鼠對脫氫表雄酮（DHEA）（雄激素的一種）誘導(dǎo)的反應(yīng)存在一定的差異。DHEA在C57BL/6J背景下誘導(dǎo)的PCOS小鼠模型比BALB/c在代謝方面更接近于PCOS患者。

現(xiàn)在有研究者認(rèn)為PCOS表現(xiàn)為多基因相關(guān)性，通過構(gòu)建多基因型小鼠可模擬PCOS癥狀。瘦素缺乏和瘦素受體缺乏小鼠表現(xiàn)出一系列的類PCOS的生殖和代謝特征，但沒有呈現(xiàn)卵巢多囊化。而下丘腦瘦素受體和胰島素受體特異性敲除小鼠，則表現(xiàn)出明顯的代謝紊亂和卵巢形態(tài)改變，與正常小鼠相比有較多的退化卵泡。雌激素受體α和芳香化酶CYP19敲除小鼠，卵巢出現(xiàn)囊性出血，不排卵。

此外，過表達(dá)人纖維溶酶原啟動物抑制劑-1小鼠，出現(xiàn)了不排卵、黃體缺失的現(xiàn)象，且有50%以上的雌鼠出現(xiàn)了卵巢多囊化。卵巢過表達(dá)神經(jīng)生長因子（NGF）的小鼠可以導(dǎo)致卵泡在竇性卵泡期出現(xiàn)閉鎖、凋亡增加、小的生長卵泡積累，LH水平有輕度的持續(xù)性升高，這使卵巢多囊化的幾率增加�？偨Y(jié)如表1。

表1：不同基因修飾PCOS小鼠模型的特征^[12]

 

• 卵巢早衰動物模型^[13]

近年來，卵巢早衰（POF）（又稱為早發(fā)性卵巢功能不全（POI））的發(fā)生率每年上升，且不斷向低齡化趨勢發(fā)展，成為中國女性不孕的常見病因之一。根據(jù)POF不同的發(fā)病機(jī)制,目前已經(jīng)成功構(gòu)建的模型有：基因敲除模型、自身免疫模型、放療模型、化療藥物模型、卵巢切除模型、D-半乳糖模型以及環(huán)境損傷模型等。這里主要介紹基因敲除模型。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)了與POF發(fā)生相關(guān)的基因，包括脆性X智力低下基因 1（FMR1）、骨形成發(fā)生蛋白15基因（BMP 15）、生長分化因子9基因（GDF9）、叉頭框L2基因（FOXL2）等。FOXL2是調(diào)控基因表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在顆粒細(xì)胞的發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，敲除雌性小鼠FOXL2基因后，發(fā)現(xiàn)小鼠顆粒細(xì)胞停止生長，隨后卵母細(xì)胞死亡，大量卵泡閉鎖，生育能力降低。BMP15 通過促進(jìn)卵母細(xì)胞發(fā)育、防止顆粒細(xì)胞凋亡，參與促進(jìn)卵泡生長和成熟；BMP15基因敲除雌性小鼠生育能力明顯下降。

表2：各種常見POF動物模型建模方法比較^[13]

南模生物優(yōu)吉鼠模型資源庫含多種自主構(gòu)建的不孕不育研究大小鼠模型，可用于不孕不育癥的基礎(chǔ)研究和藥物開發(fā)，詳細(xì)模型信息見下表：

*臨床相關(guān)性代表目的基因的同源人類基因在臨床上報道過與該生殖系統(tǒng)疾病有相關(guān)性。
#品系表型預(yù)測代表有文獻(xiàn)報道過具有類似基因型的小鼠出現(xiàn)過該生殖系統(tǒng)疾病的表型。

南模生物深耕基因編輯領(lǐng)域，提供全方位模式生物服務(wù)，包括基因修飾成品模型供應(yīng)、個性化模型定制、飼養(yǎng)繁育、表型分析、藥效評價等，滿足不同實驗室需求。

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