如何利用多能干細胞（PSC）培養(yǎng)類器官
在體外建立起可以準確而完整模擬各種體內器官生理學現象的是各位生物學和醫(yī)學研究者夢寐以求的目標，而實現這個目標的第一步需要得到可以無限增殖，并能分化成各種組織或器官的干細胞，其可以是從成體來源或者從胚胎來源，后者相較之前者具有全能分化能力。雖然胚胎干細胞是自然界可以直接獲取全能的細胞，但是獲取難度大而且使用可能會有倫理問題，但是隨著2006年誘導多能干細胞（iPSC）技術1的問世這一問題得到很好的解決，可以讓研究人員選取任何體細胞進行重編程后變成多能型的干細胞（PSC），然后分化成不同的成體干細胞，最后分化成各種體細胞模，特別是人多能干細胞（hPSC）可以用來分化成各種細胞，特別是無法出活體實驗中得到的細胞。
解決了這個問題后，新的情況出現了，就是2D環(huán)境下培養(yǎng)出來的細胞往往只能貼壁在二維環(huán)境下生長，但是地球上的生命都是誕生和生長于三維環(huán)境中的，維度的缺失讓細胞間的相互作用力只存在XY軸，而沒有Y軸。此外，三維環(huán)境下多層細胞間的滲透效應也缺失了。所以最終在傳統(tǒng)2D培養(yǎng)體系中細胞永遠只能長成細胞，很多生理學功能無法實現，而且無法形成類似于組織和器官的結構。由此，將有干性細胞和腫瘤細胞在3D環(huán)境下進行培養(yǎng)，使其最終能成為類似于正常組織和器官，或相應部位腫瘤的類器官培養(yǎng)技術應運而生。常見的類器官培養(yǎng)方案的祖細胞來源是：成體干細胞和腫瘤細胞，但是這種方法局限于通過活體實驗獲取此類細胞，而且這一部分是必須在成體內存在的，但是像心肌、腦這種無法在活體獲得成體干細胞的組織，就可以使用前面介紹的iPSC通過分化調控來獲取。在這個方面的先行者之一是美國辛辛那提兒童醫(yī)院醫(yī)學中心的James M. Wells教授，他為iPSC培養(yǎng)消化系統(tǒng)相關類器官建立完整的技術流程。
在2017年他首創(chuàng)從PSC培養(yǎng)出了消化道的類器官2。讓建立體外人類器官模型更加方便，因為一般實驗室是很難獲得人的手術樣本，同時也解決了手術獲取干細胞的異質性問題；此外，還可以通過精確的分化調控產生出不同的細胞，如可以在培養(yǎng)胃底類器官時候，加BMP4處理48小時可以長出胃壁細胞3；最后，還因為iPSC保留了宿主的全部基因序列（含突變）），所以可以模擬出各個組織因為遺傳因素可能出現病變。但是這樣培養(yǎng)出來的類器官也有其缺陷，因為畢竟還是在培養(yǎng)皿中進行培養(yǎng)，所以無法形成體內的環(huán)境，如神經系統(tǒng)的控制、循環(huán)系統(tǒng)對養(yǎng)分的更新，所以這些消化道的類器官不傳代的情況下能培養(yǎng)時間一般在2周，最長不過4周，而傳代就意味著類器官會被打散，因而造成其能生長的尺寸有限。而James M. Wells教授為此做出了兩個解決方案。其一是使用器官芯片技術，在這種微流控芯片中進行培養(yǎng)，這樣可以通過芯片的腔室和外置蠕動泵來模擬出體內的循環(huán)，從而延長單代次生長時間，進而更大，而且借助液流系統(tǒng)可以方便地控制加入藥物和各位微生物或病毒的濃度和時間，便于完成藥敏、藥代和感染實驗4。其二是將培養(yǎng)過的類器官植入在免疫缺陷小鼠的體內，讓其可以融合到小鼠的器官上，讓類器官可與宿主的神經系統(tǒng)和循環(huán)系統(tǒng)融合，不但可以讓其長得較之在培養(yǎng)皿中更大，可以達到近千倍，而在最新文章中報道，這種植入的類器官在宿主體內開始發(fā)育出布倫納氏腺這樣有分泌功能的復雜結構，從而這種升級版的類器官為讓其往器官移植方面的應用建立了基礎5。
到這里，是不是大家對James M. Well教授的這套技術路線非常感興趣呢？但PSC實驗流程很長，對分化節(jié)點的把握至關重要，因為細胞的狀態(tài)瞬息萬變，如果涉及熒光染色和拍照可能會耽誤這些重要節(jié)點，從明場觀察到的活細胞的狀態(tài)下就進行后續(xù)實驗判斷非常重要，所以后續(xù)部分我們先就以胃類器官為例，將培養(yǎng)過程中涉及明場形態(tài)觀察的要點進行介紹，具體操作步驟可以點擊此鏈接查看原文。
下圖中的明場圖像皆來自Leica-Microsystems的S APO體視鏡，其擁有復消色差（APO）鏡頭，可以實現 8:1 變倍比以及高達 80x 的強大放大能力，此類鏡頭適用于可見光譜及更大范圍內最高規(guī)格的應用，可以讓您方便觀察和拍攝干細胞培養(yǎng)過程和分化結果。
hPSC-胃類器官（GOs）培養(yǎng)過程中明場圖像解析3：
整個技術流程如圖1所示，圖1a中介紹了整個流程需要34天，可以從hPSC分化培養(yǎng)成胃竇類器官（hAGOs）和人胃底類器官（hFGOs）。而這2種類器官在前6天（即：Day0-5）處理方式一樣，都是分化成后段前腸球體（posterior foregut spheroids），然后包埋到基質膠中，進行后續(xù)的處理。而前6天的步驟中，第一階段前3天需要加入Activin A和BMP4，讓hPSC分化成單層的定形的內胚層（DE），其的標記物是SOX17和FOXA2。而第二階段的3天需要添加Chiron、FGF4、Noggin和RA（第5天加入）形成3D懸浮的前腸球體，其的標記物是HNF1β和SOX2。
然后將懸浮的前腸球體包埋進基質膠中，如果要培養(yǎng)出hAGOs需要添加EGF、Noggin和RA先處理3天，接下來用添加EGF處理3周。如果是培養(yǎng)hFGOs，則是用EGF、CHIR、Noggin和 RA處理3天。在培養(yǎng)體系中，Noggin作為BMP信號通路的抑制劑，可以啟動前腸球體的發(fā)育；RA讓前腸發(fā)育成后部前腸，后者的標記物是HNF1B和GATA4。在處理的3天中，經典wnt信號通路的激活可以讓GOs形成胃底上皮，CHIR這個小分子可以起到該作用。在Day 9，胃底球體在含有CHIR和EGF的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在Day 20加入FGF10直到流程結束。在Day 30的時候需要降低EGF的濃度，這樣可以增加hAGOs和hFGOs中內分泌細胞的數量。在Day 30 對hFGOs 進行48小時的BMP4和PD032591處理可以刺激其產生胃壁細胞。
圖1 培育和分化流程。
圖2 | 第0-3天，觀察目標hPSC細胞的適當匯合度，以確保hPSC能分化為DE和穩(wěn)定生成后部前腸球狀體。 a. 細胞按不同比例進行單細胞傳代后1天，hPSC的第0天圖像，三組圖片分別展示了低、目標和過高的匯合度。a組上部分別是傳代后的hPSC在低倍放大的情況想下低的匯合度（左）、目標匯合度（中）和過于密集的匯合度（右）。而a組下部依次是低的匯合度（左）、目標匯合度（中）和過于密集的匯合度（右）。b. 第3天，在3天Activin A處理結束時，達到目標匯度的DE細胞單層的低倍（頂部）和高倍（中間和底部）圖像。c. 第6天預期的球狀體生成低倍圖像，生成結果為差（左）、旺盛（中間）和中等（右）。a,b. 在圖像采集前更換培養(yǎng)基以去除細胞碎片。比例尺，1mm（a,b（頂部和中心），c）；250 μm（b，底部）。【注：因為要保證各個圖像的亮度匹配，所以對a中頂部圖像的亮度進行了調整�！�
圖3 - 第4-20天，后前腸球狀體生成、hAGOs和hFGOs在基質膠中生長相關的形態(tài)學變化。a. (上排)，第4天的低倍（左）和高倍（右）放大圖像，整個孔中出現了可以形成球狀體的單層細胞，表現為3D出芽形態(tài)。（中排）第5天，可以形成球狀體的單層細胞的低倍（左）和高倍（右）放大圖像，因為3D形態(tài)形成了許多貼壁的出芽球狀體和一些自由漂浮的球狀體。（下排）第6天的低倍（左）和高倍（右），可以形成球狀體的單層細胞（其中有大量可以進行收集的自由漂浮球狀體），單層細胞基本上沒有3D出芽形態(tài)。b. 第6天，自由漂浮在培養(yǎng)基中的單個球狀體的高倍放大圖像。來自同一代的球狀體在形狀和大小上各不相同，但都被包被在基質膠中以備將來生長。c. 在基質膠中的胃竇和胃底球狀體在第9天（上排）、第13天（第二排）和第20天（第三排）長成hGO的低倍倍放大圖像。插圖顯示了基質膠中單個球狀體的放大圖像。（下排）第20天高倍放大的hAGO和hFGO圖像，有大量非計劃的神經生長（綠色箭頭）。在選擇hGO作進一步培養(yǎng)時，應避免選擇這種hGO，以減少密度。比例尺，1 mm（a,c），250μm（b）。白色方框內的插圖是5倍數字放大的圖像；插圖的寬度為~833μm（c）。【注：對c的上排圖像亮度進行了調整，以使其與其他圖像的亮度匹配。】
圖4 – 降低了EGF濃度后，在基質膠中生長的hGO中胃竇和胃壁細胞的狀態(tài)。 白色箭頭指示hAGO發(fā)育出的內部腺體。黃色箭頭表示在hFGO中發(fā)育出外部腺體的出芽。綠色箭頭指示了一個在低EGF濃度下發(fā)育出來的神經叢。a,b,在Day 24（上排）、27（中排）和34（下排），在基質膠中生長的hAGO和hFGO的低倍（左）和高倍（右）放大圖像。a（下排），發(fā)育后的hAGO顯示有清晰的管腔和旺盛的內部腺體。b（下排），發(fā)育后的hFGOs顯示有旺盛的外部腺體出芽，腔內可能含有或不含有很多細胞碎片。比例尺，1 mm�！咀ⅲ簩ο屡艌D像的亮度進行了調整，以使其與其他圖像的亮度匹配�！�
下一篇將會為大家?guī)眍惼鞴僖浦驳矫庖呷毕菪∈蟮牟僮髁鞒探馕觥?br />
1. Kazutoshi Takahashi, Shinya Yamanaka. (2006). Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell 126, 663–676.
2. McCauley, H.A., and Wells, J.M. (2017). Pluripotent stem cell-derived organoids: using principles of developmental biology to grow human tissues in a dish. Development 144, 958–962.
3. Taylor R. Broda. Et al. (2018) Generation of human antral and fundic gastric organoids from pluripotent stem cells. Nature Protocol 14, pages28–50
4. Kang Kug Leea. Et al. (2018) Human stomach-on-a-chip with luminal flow and peristaltic-like motility. Lab Chip 18(20): 3079–3085.
5. Alexandra K. Eicher. Et al. (2022) Functional human gastrointestinal organoids can be engineered from three primary germ layers derived separately from pluripotent stem cells. Cell Stem Cell 29, 36–51
了解更多：徠卡顯微
解決了這個問題后，新的情況出現了，就是2D環(huán)境下培養(yǎng)出來的細胞往往只能貼壁在二維環(huán)境下生長，但是地球上的生命都是誕生和生長于三維環(huán)境中的，維度的缺失讓細胞間的相互作用力只存在XY軸，而沒有Y軸。此外，三維環(huán)境下多層細胞間的滲透效應也缺失了。所以最終在傳統(tǒng)2D培養(yǎng)體系中細胞永遠只能長成細胞，很多生理學功能無法實現，而且無法形成類似于組織和器官的結構。由此，將有干性細胞和腫瘤細胞在3D環(huán)境下進行培養(yǎng)，使其最終能成為類似于正常組織和器官，或相應部位腫瘤的類器官培養(yǎng)技術應運而生。常見的類器官培養(yǎng)方案的祖細胞來源是：成體干細胞和腫瘤細胞，但是這種方法局限于通過活體實驗獲取此類細胞，而且這一部分是必須在成體內存在的，但是像心肌、腦這種無法在活體獲得成體干細胞的組織，就可以使用前面介紹的iPSC通過分化調控來獲取。在這個方面的先行者之一是美國辛辛那提兒童醫(yī)院醫(yī)學中心的James M. Wells教授，他為iPSC培養(yǎng)消化系統(tǒng)相關類器官建立完整的技術流程。
在2017年他首創(chuàng)從PSC培養(yǎng)出了消化道的類器官2。讓建立體外人類器官模型更加方便，因為一般實驗室是很難獲得人的手術樣本，同時也解決了手術獲取干細胞的異質性問題；此外，還可以通過精確的分化調控產生出不同的細胞，如可以在培養(yǎng)胃底類器官時候，加BMP4處理48小時可以長出胃壁細胞3；最后，還因為iPSC保留了宿主的全部基因序列（含突變）），所以可以模擬出各個組織因為遺傳因素可能出現病變。但是這樣培養(yǎng)出來的類器官也有其缺陷，因為畢竟還是在培養(yǎng)皿中進行培養(yǎng)，所以無法形成體內的環(huán)境，如神經系統(tǒng)的控制、循環(huán)系統(tǒng)對養(yǎng)分的更新，所以這些消化道的類器官不傳代的情況下能培養(yǎng)時間一般在2周，最長不過4周，而傳代就意味著類器官會被打散，因而造成其能生長的尺寸有限。而James M. Wells教授為此做出了兩個解決方案。其一是使用器官芯片技術，在這種微流控芯片中進行培養(yǎng)，這樣可以通過芯片的腔室和外置蠕動泵來模擬出體內的循環(huán)，從而延長單代次生長時間，進而更大，而且借助液流系統(tǒng)可以方便地控制加入藥物和各位微生物或病毒的濃度和時間，便于完成藥敏、藥代和感染實驗4。其二是將培養(yǎng)過的類器官植入在免疫缺陷小鼠的體內，讓其可以融合到小鼠的器官上，讓類器官可與宿主的神經系統(tǒng)和循環(huán)系統(tǒng)融合，不但可以讓其長得較之在培養(yǎng)皿中更大，可以達到近千倍，而在最新文章中報道，這種植入的類器官在宿主體內開始發(fā)育出布倫納氏腺這樣有分泌功能的復雜結構，從而這種升級版的類器官為讓其往器官移植方面的應用建立了基礎5。
到這里，是不是大家對James M. Well教授的這套技術路線非常感興趣呢？但PSC實驗流程很長，對分化節(jié)點的把握至關重要，因為細胞的狀態(tài)瞬息萬變，如果涉及熒光染色和拍照可能會耽誤這些重要節(jié)點，從明場觀察到的活細胞的狀態(tài)下就進行后續(xù)實驗判斷非常重要，所以后續(xù)部分我們先就以胃類器官為例，將培養(yǎng)過程中涉及明場形態(tài)觀察的要點進行介紹，具體操作步驟可以點擊此鏈接查看原文。
下圖中的明場圖像皆來自Leica-Microsystems的S APO體視鏡，其擁有復消色差（APO）鏡頭，可以實現 8:1 變倍比以及高達 80x 的強大放大能力，此類鏡頭適用于可見光譜及更大范圍內最高規(guī)格的應用，可以讓您方便觀察和拍攝干細胞培養(yǎng)過程和分化結果。
hPSC-胃類器官（GOs）培養(yǎng)過程中明場圖像解析3：
整個技術流程如圖1所示，圖1a中介紹了整個流程需要34天，可以從hPSC分化培養(yǎng)成胃竇類器官（hAGOs）和人胃底類器官（hFGOs）。而這2種類器官在前6天（即：Day0-5）處理方式一樣，都是分化成后段前腸球體（posterior foregut spheroids），然后包埋到基質膠中，進行后續(xù)的處理。而前6天的步驟中，第一階段前3天需要加入Activin A和BMP4，讓hPSC分化成單層的定形的內胚層（DE），其的標記物是SOX17和FOXA2。而第二階段的3天需要添加Chiron、FGF4、Noggin和RA（第5天加入）形成3D懸浮的前腸球體，其的標記物是HNF1β和SOX2。
然后將懸浮的前腸球體包埋進基質膠中，如果要培養(yǎng)出hAGOs需要添加EGF、Noggin和RA先處理3天，接下來用添加EGF處理3周。如果是培養(yǎng)hFGOs，則是用EGF、CHIR、Noggin和 RA處理3天。在培養(yǎng)體系中，Noggin作為BMP信號通路的抑制劑，可以啟動前腸球體的發(fā)育；RA讓前腸發(fā)育成后部前腸，后者的標記物是HNF1B和GATA4。在處理的3天中，經典wnt信號通路的激活可以讓GOs形成胃底上皮，CHIR這個小分子可以起到該作用。在Day 9，胃底球體在含有CHIR和EGF的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在Day 20加入FGF10直到流程結束。在Day 30的時候需要降低EGF的濃度，這樣可以增加hAGOs和hFGOs中內分泌細胞的數量。在Day 30 對hFGOs 進行48小時的BMP4和PD032591處理可以刺激其產生胃壁細胞。
圖1 培育和分化流程。
圖2 | 第0-3天，觀察目標hPSC細胞的適當匯合度，以確保hPSC能分化為DE和穩(wěn)定生成后部前腸球狀體。 a. 細胞按不同比例進行單細胞傳代后1天，hPSC的第0天圖像，三組圖片分別展示了低、目標和過高的匯合度。a組上部分別是傳代后的hPSC在低倍放大的情況想下低的匯合度（左）、目標匯合度（中）和過于密集的匯合度（右）。而a組下部依次是低的匯合度（左）、目標匯合度（中）和過于密集的匯合度（右）。b. 第3天，在3天Activin A處理結束時，達到目標匯度的DE細胞單層的低倍（頂部）和高倍（中間和底部）圖像。c. 第6天預期的球狀體生成低倍圖像，生成結果為差（左）、旺盛（中間）和中等（右）。a,b. 在圖像采集前更換培養(yǎng)基以去除細胞碎片。比例尺，1mm（a,b（頂部和中心），c）；250 μm（b，底部）。【注：因為要保證各個圖像的亮度匹配，所以對a中頂部圖像的亮度進行了調整�！�
圖3 - 第4-20天，后前腸球狀體生成、hAGOs和hFGOs在基質膠中生長相關的形態(tài)學變化。a. (上排)，第4天的低倍（左）和高倍（右）放大圖像，整個孔中出現了可以形成球狀體的單層細胞，表現為3D出芽形態(tài)。（中排）第5天，可以形成球狀體的單層細胞的低倍（左）和高倍（右）放大圖像，因為3D形態(tài)形成了許多貼壁的出芽球狀體和一些自由漂浮的球狀體。（下排）第6天的低倍（左）和高倍（右），可以形成球狀體的單層細胞（其中有大量可以進行收集的自由漂浮球狀體），單層細胞基本上沒有3D出芽形態(tài)。b. 第6天，自由漂浮在培養(yǎng)基中的單個球狀體的高倍放大圖像。來自同一代的球狀體在形狀和大小上各不相同，但都被包被在基質膠中以備將來生長。c. 在基質膠中的胃竇和胃底球狀體在第9天（上排）、第13天（第二排）和第20天（第三排）長成hGO的低倍倍放大圖像。插圖顯示了基質膠中單個球狀體的放大圖像。（下排）第20天高倍放大的hAGO和hFGO圖像，有大量非計劃的神經生長（綠色箭頭）。在選擇hGO作進一步培養(yǎng)時，應避免選擇這種hGO，以減少密度。比例尺，1 mm（a,c），250μm（b）。白色方框內的插圖是5倍數字放大的圖像；插圖的寬度為~833μm（c）。【注：對c的上排圖像亮度進行了調整，以使其與其他圖像的亮度匹配。】
圖4 – 降低了EGF濃度后，在基質膠中生長的hGO中胃竇和胃壁細胞的狀態(tài)。 白色箭頭指示hAGO發(fā)育出的內部腺體。黃色箭頭表示在hFGO中發(fā)育出外部腺體的出芽。綠色箭頭指示了一個在低EGF濃度下發(fā)育出來的神經叢。a,b,在Day 24（上排）、27（中排）和34（下排），在基質膠中生長的hAGO和hFGO的低倍（左）和高倍（右）放大圖像。a（下排），發(fā)育后的hAGO顯示有清晰的管腔和旺盛的內部腺體。b（下排），發(fā)育后的hFGOs顯示有旺盛的外部腺體出芽，腔內可能含有或不含有很多細胞碎片。比例尺，1 mm�！咀ⅲ簩ο屡艌D像的亮度進行了調整，以使其與其他圖像的亮度匹配�！�
下一篇將會為大家?guī)眍惼鞴僖浦驳矫庖呷毕菪∈蟮牟僮髁鞒探馕觥?br />
1. Kazutoshi Takahashi, Shinya Yamanaka. (2006). Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell 126, 663–676.
2. McCauley, H.A., and Wells, J.M. (2017). Pluripotent stem cell-derived organoids: using principles of developmental biology to grow human tissues in a dish. Development 144, 958–962.
3. Taylor R. Broda. Et al. (2018) Generation of human antral and fundic gastric organoids from pluripotent stem cells. Nature Protocol 14, pages28–50
4. Kang Kug Leea. Et al. (2018) Human stomach-on-a-chip with luminal flow and peristaltic-like motility. Lab Chip 18(20): 3079–3085.
5. Alexandra K. Eicher. Et al. (2022) Functional human gastrointestinal organoids can be engineered from three primary germ layers derived separately from pluripotent stem cells. Cell Stem Cell 29, 36–51
了解更多：徠卡顯微
