文獻(xiàn)解讀：北大李毓龍課題組構(gòu)建的一種全新ATP熒光探針

文章概述

三磷酸腺苷（Adenosine 50-triphosphate，ATP）是一種廣泛存在于體內(nèi)的能量存儲(chǔ)分子。除了參與細(xì)胞內(nèi)的能量代謝功能外，越來越多的證據(jù)表明，釋放到細(xì)胞外空間的ATP可以作為一種分子信號(hào)（嘌呤能遞質(zhì)），能夠結(jié)合并激活離子型P2X受體以及代謝型P2Y受體。在神經(jīng)系統(tǒng)中，釋放的ATP參與了多中生理病理過程，包括痛覺感受、機(jī)械/化學(xué)感知信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、突觸傳遞、損傷、炎癥等。對(duì)于ATP在這些生理過程中的作用，目前的研究并未完全闡明。為了進(jìn)一步研究ATP的生理功能，2021年12月22日，北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院李毓龍教授團(tuán)隊(duì)發(fā)表在《Neuron》期刊上發(fā)表題為“A sensitive GRAB sensor for detecting extracellular ATP in vitro and in vivo”的研究論文，該項(xiàng)工作展示了團(tuán)隊(duì)最新開發(fā)的一種可遺傳編碼的熒光分子探針——GRABATP1.0（簡(jiǎn)稱ATP1.0；GRAB：G protein-coupled receptor activation-based sensors），該探針以P2Y受體作為ATP的結(jié)合支架，能夠?qū)��?xì)胞外的ATP進(jìn)行高靈敏度、高選擇性以及高時(shí)空分辨率的實(shí)時(shí)測(cè)量。該項(xiàng)工作是李毓龍教授團(tuán)隊(duì)在相繼開發(fā)了乙酰膽堿、多巴胺、去甲腎上腺素、血清素和腺苷等一系列分子探針之后的后又一重要成果，對(duì)于我們深入研究并理解ATP的生理功能具有重要意義。

 

核心觀點(diǎn)

1、ATP1.0是一個(gè)可遺傳編碼的細(xì)胞外ATP感受器；

2、ATP1.0對(duì)于細(xì)胞外ATP具有高敏感性和高時(shí)空分辨率；

3、ATP1.0可用于離體以及在體ATP釋放的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。

研究結(jié)果分析

1. ATP1.0表現(xiàn)出卓越的細(xì)胞外ATP檢測(cè)性能

為了開發(fā)一個(gè)遺傳編碼的ATP熒光探針，研究者首先系統(tǒng)地篩選了能夠被ATP激活的G蛋白耦合受體（G protein-coupled receptors, GPCRs），包括人源的P2Y1、P2Y2、P2Y4、P2Y11、P2Y12和P2Y13等。以這些GPCRs作為支架，研究者將結(jié)構(gòu)敏感的綠色熒光蛋白（circularly permuted enhanced GFP, cpEGFP）插入到這些受體結(jié)構(gòu)中。其中hP2Y1在插入cpEGFP后表現(xiàn)出最佳的膜轉(zhuǎn)運(yùn)和對(duì)ATP的響應(yīng)性，因此隨后研究者選擇了基于hP2Y1的嵌合體ATP0.1進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，并且最終得到了對(duì)ATP熒光響應(yīng)性最好的ATP1.0。當(dāng)ATP1.0在HEK293T細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，它能夠很好的被運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞膜上表達(dá)，并對(duì)細(xì)胞外100mM的ATP產(chǎn)生一個(gè)~500%的dF/F0峰值。在特異性方面，ATP1.0對(duì)細(xì)胞外ATP的反應(yīng)能夠被P2Y1的拮抗劑MRS-2500阻斷。ATP1.0對(duì)其它遞質(zhì)不會(huì)產(chǎn)生反應(yīng)，包括谷氨酸、GABA、甘氨酸、多巴胺、去甲腎上腺素、血清素、組胺和乙酰膽堿等，對(duì)二磷酸腺苷（Adenosine Diphosphate, ADP）的反應(yīng)與ATP類似，但是對(duì)于其它結(jié)構(gòu)類似的嘌呤能分子或衍生物，如一磷酸腺苷、腺苷、二磷酸尿核苷等幾乎不產(chǎn)生反應(yīng)。ATP1.0的反應(yīng)具有快速動(dòng)力學(xué)的特征，其反應(yīng)平均上升時(shí)間常數(shù)約為28 ms，平均衰減時(shí)間常數(shù)約為283 ms。在熒光強(qiáng)度上，ATP1.0被ATP激活時(shí)的亮度達(dá)到了直接表達(dá)hP2Y1-EGFP融合蛋白熒光強(qiáng)度的64%，并且ATP1.0在單光子激發(fā)下的光譜與EGFP相似，激發(fā)峰在500 nm，發(fā)射峰在520 nm。在與其它細(xì)胞外ATP分子探針的比較中，ATP1.0表現(xiàn)出更大的動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍、更強(qiáng)的熒光反應(yīng)、以及更低的信噪比。

 

接下來，研究者探討了ATP1.0在原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元中的表達(dá)能力以及反應(yīng)性。ATP1.0能夠廣泛的表達(dá)到星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的細(xì)胞上，包括胞體、突起等部位。表達(dá)到星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元上的ATP1.0對(duì)細(xì)胞外ATP均有較好的反應(yīng)，其平均dF/F0峰值分別約為1000%和780%。此外，ATP誘導(dǎo)的熒光反應(yīng)也能夠被P2Y1、受體拮抗劑MRS-2500阻斷。此外，與HEK293T中結(jié)果相似，神經(jīng)元中表達(dá)的ATP1.0對(duì)ATP和ADP均有反應(yīng)，但對(duì)一磷酸腺苷、腺苷、二磷酸尿核苷均無(wú)反應(yīng)。更重要的是，ATP1.0在細(xì)胞表面非常穩(wěn)定，在給予10mM 的ATP 兩小時(shí)后，表達(dá)ATP1.0的神經(jīng)元的熒光沒有出現(xiàn)明顯下降。綜上所述，ATP1.0能夠適用于多種類型的細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞外的ATP產(chǎn)生高靈敏度、高選擇性和高穩(wěn)定性的熒光增強(qiáng)反應(yīng)。

 

2. ATP1.0可用于監(jiān)測(cè)體外培養(yǎng)細(xì)胞外的ATP水平

接下來，研究者測(cè)試了ATP1.0是否能夠用于檢測(cè)神經(jīng)-膠質(zhì)共培養(yǎng)細(xì)胞中內(nèi)源性ATP的釋放。在大腦中，機(jī)械刺激和細(xì)胞腫脹均能誘發(fā)胞內(nèi)ATP被釋放。在表達(dá)ATP1.0的細(xì)胞中，給予細(xì)胞機(jī)械刺激（利用玻璃微電極按壓某個(gè)細(xì)胞），能夠引起一個(gè)快速、局部增強(qiáng)的dF/F0信號(hào)，反映了ATP的釋放。為了誘導(dǎo)細(xì)胞腫脹，研究者將細(xì)胞浸泡在低滲溶液（130 mOsm/kg）中;在1min內(nèi)，dF/F0信號(hào)顯著增加。并且在應(yīng)用MRS-2500后，這兩種刺激引起的反應(yīng)都被完全抑制。研究者還發(fā)現(xiàn)，低滲刺激誘導(dǎo)的ATP釋放可能不需要依賴經(jīng)典的SNARE囊泡釋放機(jī)制，因?yàn)榧?xì)胞表達(dá)了破傷風(fēng)毒素輕鏈（tetanus toxin light chain, TeNT，可以切割突觸短肽并阻止胞外分泌過程），但是對(duì)低滲刺激誘導(dǎo)的反應(yīng)沒有影響；而作為對(duì)照，表達(dá)TeNT阻斷了低滲刺激誘發(fā)的谷氨酸釋放。除了刺激誘發(fā)的ATP釋放外，研究者還觀察到，即使在沒有外部刺激的情況下，神經(jīng)-膠質(zhì)共培養(yǎng)細(xì)胞中也存在自發(fā)、局部、以及短暫的ATP1.0信號(hào)。在1.6mm2成像視野中，這些自發(fā)事件以1.2次/min的速率出現(xiàn)，其dF/F0的平均峰值約為210%。ATP自發(fā)釋放的平均上升時(shí)間約為11s，衰減時(shí)間約為43s，其釋放范圍的平均直徑約為32mm。為了確保ATP1.0信號(hào)反映了細(xì)胞外的ATP動(dòng)態(tài)變化，研究者利用三磷酸腺苷雙磷酸酶（ATP的水解酶）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理并成像，觀察到三磷酸腺苷雙磷酸酶能夠顯著阻斷自發(fā)事件的發(fā)生。與以前的檢測(cè)手段相比，ATP1.0具備更高的靈敏度，能夠在普通條件下特異性的檢測(cè)ATP的釋放。

 

3. ATP1.0可用于監(jiān)測(cè)斑馬魚幼體中ATP的動(dòng)態(tài)變化

在證明了ATP1.0可用于體外ATP的檢測(cè)后，研究者接著探討了它是否可以用于監(jiān)測(cè)體內(nèi)（如斑馬魚中）ATP的動(dòng)態(tài)變化。在斑馬魚幼體神經(jīng)元中特異性地表達(dá)ATP1.0后，利用ATP局部處理會(huì)引起視頂蓋中dF/ F0信號(hào)出現(xiàn)強(qiáng)烈的瞬時(shí)增加，這些信號(hào)能夠被MRS-2500阻斷。在驗(yàn)證了ATP1.0能夠?qū)ν庠碅TP做出反應(yīng)后，研究者進(jìn)一步探討了ATP1.0是否能夠用于檢測(cè)活斑馬魚內(nèi)源性ATP的釋放。ATP信號(hào)在促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞向損傷部位遷移中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在表達(dá)ATP1.0的斑馬魚中，研究者發(fā)現(xiàn)激光消融誘導(dǎo)視頂蓋損傷后會(huì)導(dǎo)致熒光增強(qiáng)，其反應(yīng)從損傷部位向外呈放射狀傳播。損傷后11s和64s釋放ATP的范圍，其平均直徑分別為~23mm和~34mm。接下來，研究者通過在斑馬魚的視頂葉中表達(dá)ATP1.0，同時(shí)監(jiān)測(cè)ATP的釋放和小膠質(zhì)細(xì)胞的遷移，斑馬魚的小膠質(zhì)細(xì)胞用紅色熒光蛋白DsRed標(biāo)記。研究者們發(fā)現(xiàn)，在激光消融后，小膠質(zhì)細(xì)胞沿著ATP傳播路徑逐漸遷移到損傷部位。因此，ATP1.0非常適用于活體斑馬魚幼蟲ATP監(jiān)測(cè)，并且具有較高的時(shí)空分辨率。

 

4. ATP1.0可用于監(jiān)測(cè)小鼠全身炎癥引起的ATP局部釋放

ATP是應(yīng)對(duì)機(jī)體急慢性炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵細(xì)胞外信使，但是在全身炎癥期間ATP釋放的模式還不清楚。研究者在小鼠腹腔注射細(xì)菌脂多糖（lipopolysaccharides, LPS）誘導(dǎo)全身炎癥，并通過雙光子顯微鏡來觀察直接觀察視覺皮層ATP1.0的熒光反應(yīng)。注射LPS 24小時(shí)后，研究者觀察到皮質(zhì)內(nèi)多次ATP局部釋放事件，在記錄的20min內(nèi)，其發(fā)生頻率約為5 – 10次/min。在星形膠質(zhì)細(xì)胞中，ATP釋放的上升時(shí)間相對(duì)較快（<5s），衰減時(shí)間較慢（10-20s）。此外，ATP的釋放具有空間選擇性性，信號(hào)的平均直徑（根據(jù)每個(gè)事件的最大直徑確定）約為9.9mm，小于典型星形膠質(zhì)細(xì)胞的平均直徑（10-20mm）。為了研究ATP釋放與炎癥進(jìn)展之間的相關(guān)性，研究者記錄了注射不同劑量LPS（分別為0.5和10 mg/kg）后不同時(shí)間點(diǎn)的皮質(zhì)ATP釋放情況。研究者發(fā)現(xiàn)，在注射LPS后30 min內(nèi)，ATP釋放均有所增加，且釋放次數(shù)隨時(shí)間逐漸增加，并分別2h和6h時(shí)達(dá)到頂峰。對(duì)ATP釋放的位置分析顯示，早期ATP釋放發(fā)生在相對(duì)靠近血管的地方，隨后釋放距離逐漸增加。這些數(shù)據(jù)表明，大腦可以感知炎癥，并以具有空間選擇性的ATP釋放的形式做出反應(yīng)，這些結(jié)果表明ATP1.0適用于小鼠在體成像，同時(shí)兼?zhèn)涓哽`敏度和高時(shí)空分辨率。

 

總結(jié)

該研究報(bào)道了一種全新的基因編碼的ATP熒光探針——ATP1.0，該探針能夠高靈敏度地檢測(cè)腦組織中ATP的動(dòng)態(tài)變化。ATP1.0可以在多種類型細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，包括細(xì)胞系、星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元，為測(cè)量細(xì)胞外ATP提供了可靠的工具。此外，利用ATP1.0可以實(shí)現(xiàn)體外及在體ATP釋放的可視化實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。

 

亮點(diǎn)研究方法

這項(xiàng)工作利用病毒注射、雙光子成像等技術(shù)來驗(yàn)證了ATP1.0在監(jiān)測(cè)細(xì)胞外ATP動(dòng)態(tài)變化中的可靠性。瑞沃德深耕神經(jīng)科學(xué)研究領(lǐng)域近20年，一直致力于為客戶提供可信賴的解決方案和服務(wù)，可提供這項(xiàng)工作中涉及的病毒注射、光纖記錄以及雙光子成像的完整解決方案。截止目前，瑞沃德產(chǎn)品及服務(wù)覆蓋海內(nèi)外 100 多個(gè)國(guó)家和地區(qū)，客戶涵蓋全球700+醫(yī)院，1000+科研院所，6000+高等院校，已助力全球科研人員發(fā)表SCI文章12000+，獲得行業(yè)廣泛認(rèn)可。