Drop-off-數(shù)字PCR法在快速檢測和定量廢水中新冠病毒及變種VOCs的應(yīng)用

廢水中檢測到新冠病毒和新冠變種，在世界各地的污水廠都有類似的報(bào)道。今年初，美國疾病控制預(yù)防中心 (CDC)發(fā)布的報(bào)告中，指出新冠病毒變種奧密克戎(Omicron)很有可能在美國首例確診病例官方聲明前一周已經(jīng)存在于紐約市的廢水中，報(bào)告同時(shí)指出，廢水監(jiān)測是一個(gè)可行的早期預(yù)警系統(tǒng)，可以幫助跟蹤新冠病毒變種的傳播。

盡管對(duì)廢水中的SARS-CoV-2 RNA測序的方法極具應(yīng)用意義，可以從單個(gè)樣本中追蹤數(shù)百人到數(shù)千人的新冠變種VOCs，但在樣本收集和分析方面存在時(shí)間滯后，測序和生物信息學(xué)管道通常需要至少3天的時(shí)間才能得到結(jié)果，為了能更快速地監(jiān)測，科學(xué)家們開發(fā)了基于PCR的分析方法，以識(shí)別其特征突變(Vogels等人，2021；Bedotto等人，2021；Chaintoutis等人，2021)。例如，針對(duì)單核苷酸多態(tài)性的檢測，如突刺蛋白中的N501Y和E484K，或特征缺失，如突刺Δ69-70和ORF1a Δ3675- 3677。

瑞士科學(xué)家Lea Caduff等使用drop-off數(shù)字PCR方法開發(fā)快速、高通量的方法來檢測和量化廢水中新冠變種的兩種缺失頻率，開發(fā)統(tǒng)計(jì)方法監(jiān)測特異性突變隨時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化，從而量化新冠變種的傳播速度，數(shù)據(jù)與臨床樣本測序結(jié)果一致。該方法基于naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)，針對(duì)廢水中新冠病毒特異性突變的數(shù)字PCR檢測提供了近實(shí)時(shí)的SARS-CoV-2 新冠變種VOCs監(jiān)測，并可能比臨床測序更早地檢測和推斷新冠變種VOCs的傳播速度，方法發(fā)表于文章“Inferring Transmission Fitness Advantage of SARS-CoV-2 Variants of Concern in Wastewater Using Digital PCR。DOI:https://doi.org/10.1101/2021.08.22.21262024。

應(yīng)用亮點(diǎn)：

▶  利用naica^®微滴芯片數(shù)字系統(tǒng)，開發(fā)出drop-off方法檢測廢水中SARS-CoV-2變種的突變頻率。

▶ 通過對(duì)大量廢水及臨床樣本的檢測分析，發(fā)現(xiàn)廢水中SARS-CoV-2變種的傳播適應(yīng)性與臨床樣品一致。

▶  Drop-off RT-dPCR方法為社區(qū)內(nèi)VOCs的快速檢測和定量提供了機(jī)會(huì)，可用于基于SARS-CoV-2的廢水流行病學(xué)的大規(guī)模檢測調(diào)查。

▶  與臨床或廢水測序相比，drop-off RT-dPCR檢測提供了一種在社區(qū)內(nèi)跟蹤突變的方法，成本更低，檢測速度更快，而且可以用于篩選VOCs的其它突變。

在COVID-19全球大流行期間，SARS-CoV-2令人擔(dān)憂的遺傳變異(VOCs)多次出現(xiàn)。VOCs的特征是傳播性增強(qiáng)，毒性增強(qiáng)，或通過先前感染或接種疫苗獲得的抗體的中和作用減弱。通常追蹤VOCs的輸入和傳播依賴于測序，對(duì)臨床樣本進(jìn)行全基因組測序。現(xiàn)在廢水監(jiān)測越來越多地被用于通過測序方法跟蹤SARS-CoV-2變種的輸入和傳播。雖然廢水中SARS-CoV-2 RNA測序是一種很有前途的方法，可以在一個(gè)樣本中跟蹤成百上千個(gè)人的VOCs，但樣本收集和分析存在時(shí)間滯后，這與臨床測試相關(guān)的滯后類似。在得到RNA樣本后，測序和生物信息學(xué)分析通常需要至少3天的時(shí)間才能得到結(jié)果。為了更快速地識(shí)別VOCs，我們開發(fā)了基于PCR的快速、高通量的方法來檢測和定量廢水中B.1.1.7、B.1.351和P.1 VOCs的兩種突變頻率。我們進(jìn)一步開發(fā)了一種統(tǒng)計(jì)方法來分析RT-dPCR檢測數(shù)據(jù)的時(shí)間動(dòng)態(tài)，以量化傳播適應(yīng)性，獲得與從臨床樣本獲得的相似的數(shù)據(jù)。針對(duì)廢水中的SARS-CoV-2數(shù)字PCR檢測提供了對(duì)VOCs的實(shí)時(shí)監(jiān)測，并可以比臨床測序更早地發(fā)現(xiàn)和推斷傳播適應(yīng)性。

在一個(gè)RT-dPCR檢測中，使用兩個(gè)非競爭性水解探針，針對(duì)同一擴(kuò)增子上的保守區(qū)域，量化廢水樣品中的突變頻率(“drop-off RT-dPCR檢測”)，可以同時(shí)定量野生型(不攜帶突變的菌株)和突變型(攜帶突變的菌株)（圖1）。

▲圖1 基于兩種不同探針的drop-off RT-dPCR檢測方法概述：一種drop-off探針（Deletion Probe）和一種Reference探針（Universal Probe）。（A）Reference探針可同時(shí)與野生型和突變型結(jié)合，而drop-off探針只與野生型結(jié)合。（B）在dPCR 2D散點(diǎn)圖中，野生型為雙陽性液滴(棕色)，而突變型為單陽性液滴(紅色)。

在2020年12月7日至2021年3月26日期間，對(duì)從廢水處理廠Werdhölzli(服務(wù)于瑞士蘇黎世約45萬人)收集的32個(gè)原始進(jìn)水(24小時(shí)流量比例復(fù)合)樣本進(jìn)行了drop-off RT-dPCR檢測，并與在蘇黎世收集并測序的2497個(gè)臨床樣本進(jìn)行對(duì)比。使用drop-off RT-dPCR方法在廢水中檢測的突變的時(shí)間趨勢與臨床樣本的測序數(shù)據(jù)一致（圖2）。

▲圖2 與蘇黎世臨床樣本相比，廢水樣本中 (A) spike Δ69-70 和 (B) ORF1a Δ3675-3677 的突變頻率，以及蘇黎世臨床樣本中 B.1.1.7 譜系的突變頻率。擬合曲線對(duì)應(yīng)于廢水和臨床數(shù)據(jù)缺失的三參數(shù)擬合和 B.1.1.7 臨床數(shù)據(jù)的兩參數(shù)擬合。陰影區(qū)域?qū)��?yīng)于 95% 的置信帶。(C) spike Δ69-70 和 (D) ORF1a Δ3675-3677 的 SARS-CoV-2 RNA（灰色）濃度和缺失等位基因（藍(lán)色）濃度，在廢水樣品中。(E) spike Δ69-70 和 (F) ORF1a Δ3675-3677，蘇黎世測序的臨床樣本數(shù)量（灰色）和缺失等位基因（紅色）的樣本數(shù)量。（G， H) 蘇黎世測序的臨床樣本數(shù)量（灰色）和B.1.1.7 譜系的樣本數(shù)量（橙色）。

使用dPCR技術(shù)跟蹤廢水中VOCs的特征突變(ORF1aΔ3675-3677和spikeΔ69-70)的時(shí)間趨勢可以迅速告知變異傳播性。來自廢水的生長速率和傳播適應(yīng)性估計(jì)值與來自臨床樣本的估計(jì)值基本一致，95%置信區(qū)間重疊。由于dPCR樣本分析比全基因組測序更快，一旦識(shí)別出特征突變，可以幫助我們早期洞察新變異的傳播性。本研究可以幫助大家進(jìn)行SARS-CoV-2變種的傳播性研究。

參考文獻(xiàn)：

1、Bedotto, Marielle, et al. 2021. “Implementation of an in-House Real-Time Reverse Transcription-PCR Assay for the Rapid Detection of the SARS-CoV-2 Marseille-4 Variant.” Journal of Clinical Virology: The Official Publication of the Pan American Society for Clinical Virology 139 (June): 104814.

2、Chaintoutis, et al. 2021. “A One-Step Real-Time RT-PCR Assay for Simultaneous Typing of SARS-CoV-2 Mutations Associated with the E484K and N501Y Spike Protein Amino-Acid Substitutions.” medRxiv. https://doi.org/10.1101/2021.05.31.21257367.

3、Fernandez-Cassi, et al.. “Wastewater Monitoring Outperforms Case Numbers as a Tool to Track COVID-19 Incidence Dynamics When Test Positivity Rates Are High.” https://doi.org/10.1101/2021.03.25.21254344.

4、Crits-Christoph,  et al. 2021. “Genome Sequencing of Sewage Detects Regionally Prevalent SARS-CoV-2 Variants.” mBio 12 (1). https://doi.org/10.1128/mBio.02703-20.