創(chuàng)傷性壓縮應(yīng)力通過長(zhǎng)鏈非編碼 RNA Dancr 抑制成骨細(xì)胞分化

咬合創(chuàng)傷被定義為一種病理性損傷，發(fā)生在創(chuàng)傷力超過牙周組織的修復(fù)能力時(shí)。咬合創(chuàng)傷作為重要的局部影響因素，在伴有牙周炎或明顯的局部刺激因素時(shí)，可能會(huì)加重牙周袋和牙槽骨的吸收。然而，這些加重影響的真正機(jī)制仍不清楚。

牙槽骨缺損主要有兩個(gè)原因：破骨細(xì)胞增多導(dǎo)致骨吸收增加，成骨細(xì)胞功能受損導(dǎo)致骨形成減少。一些研究側(cè)重于將機(jī)械刺激轉(zhuǎn)化為生化信號(hào)，以探索咬合創(chuàng)傷對(duì)破骨細(xì)胞形成的影響和機(jī)制。然而，很少有研究關(guān)注成骨細(xì)胞功能受損和骨形成的影響。

NF-κB 作為主要的分子信號(hào)通路之一，在調(diào)節(jié)骨重塑過程中發(fā)揮著重要作用。已有的研究發(fā)現(xiàn)，咬合創(chuàng)傷通過炎癥細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-1 和白細(xì)胞介素-6 間接激活 NF-κB 信號(hào)通路，NF-κB 信號(hào)通路的激活抑制了 Wnt/β-catenin 信號(hào)通路，從而抑制了成骨細(xì)胞分化。因此，NF-κB 信號(hào)通路可以響應(yīng)機(jī)械刺激調(diào)節(jié)骨形成。而應(yīng)激誘導(dǎo)的 NF-κB 信號(hào)激活的潛在機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

長(zhǎng)鏈非編碼 RNA（lncRNA）是一種長(zhǎng)度大于 200 個(gè)核苷酸的 RNA，從基因組轉(zhuǎn)錄但不翻譯成蛋白質(zhì)。LncRNA 逐漸被發(fā)現(xiàn)具有廣泛的生物學(xué)功能，如調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞周期、細(xì)胞分化等。DANCR（分化拮抗非蛋白質(zhì)編碼 RNA）是一種新發(fā)現(xiàn)的 lncRNA，最早由 Kretz 等人在表皮分化過程中鑒定出來。最近有報(bào)道稱，DANCR 可抑制人牙周膜干細(xì)胞（PDLSCs）的成骨分化，其調(diào)節(jié)功能與 Wnt/β-catenin 通路有關(guān)。研究還發(fā)現(xiàn)，DANCR 與 zeste 基因增強(qiáng)子同源物2（EZH2）相關(guān)，從而導(dǎo)致 RUNX2（Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2）表達(dá)和隨后的成骨分化受到抑制。

基于這些發(fā)現(xiàn)，四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院心血管內(nèi)科、口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的課題組曾假設(shè) Dancr 可能參與創(chuàng)傷應(yīng)激對(duì)成骨分化的抑制作用，研究旨在探索其在這種致病過程中的潛在功能和分子機(jī)制。

MC3T3-E1 細(xì)胞在壓力加載過程中成骨分化和 Dancr 表達(dá)受到抑制
為了確定 MC3T3-E1 細(xì)胞（胚胎成骨細(xì)胞系）中的成骨分化和 Dancr 表達(dá)是否受到影響，實(shí)驗(yàn)在誘導(dǎo)成骨 5 天后用 4000 μstrain 的循環(huán)單軸壓縮應(yīng)力來模擬外傷力，處理細(xì)胞 0、0.5、1、3 和 6 小時(shí)。RT-PCR 和蛋白質(zhì)印跡表明，壓縮應(yīng)力在 0.5、1、3 和 6 小時(shí)時(shí)抑制信使 RNA（mRNA）和 Alp 的蛋白表達(dá)。Runx2 的表達(dá)水平在 0.5、1 和 3 小時(shí)受到抑制。此外，發(fā)現(xiàn)，Dancr 的 RNA 表達(dá)顯著下降，在 3 小時(shí)達(dá)到低谷。因此，在以下實(shí)驗(yàn)中使用了 3 小時(shí)的壓縮應(yīng)力負(fù)荷。

Dancr 的沉默促進(jìn)了壓力誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞分化抑制
定量 RT-PCR 顯示，誘導(dǎo)成骨分化后顯著增強(qiáng)了 Dancr、Alp 和 Runx2 在第 5 天和第 7 天的表達(dá)水平。Dancr-siRNA抑制了 Dancr 的表達(dá)水平，導(dǎo)致 Alp 和 Runx2 的 mRNA 和蛋白水平降低。Dancr-siRNA 也抑制了 Alp 活性。此外，在壓縮應(yīng)力加載后，與對(duì)照 siRNA 組相比，Dancr-siRNA 處理的細(xì)胞表達(dá)的 Alp 和 Runx2 表達(dá)水平較低。結(jié)果表明，Dancr 沉默抑制了成骨細(xì)胞分化，促進(jìn)了創(chuàng)傷應(yīng)激對(duì)成骨細(xì)胞分化的抑制作用。

Dancr 的過表達(dá)可在一定程度上緩解壓力對(duì)成骨細(xì)胞分化的抑制作用
為了進(jìn)一步測(cè)試 Dancr 在成骨細(xì)胞分化中的作用，通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染在 MC3T3-E1 細(xì)胞中過表達(dá) Dancr，然后用誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞 5 天。首先，實(shí)驗(yàn)證實(shí)了 Dancr 被 Dancr 特異性質(zhì)粒顯著過表達(dá)。然后發(fā)現(xiàn)，Dancr 過表達(dá)對(duì) MC3T3-E1 細(xì)胞的成骨分化影響不大。對(duì)照組和 Dancr 過表達(dá)組之間的 Alp 活性沒有顯著差異。

接下來研究了過表達(dá) Dancr 對(duì)壓力誘導(dǎo)的成骨分化抑制的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒的組相比，在成骨分化和壓縮力加載后，Dancr 過表達(dá)增強(qiáng)了 Alp 和 Runx2 的表達(dá)。結(jié)果表明，Dancr 的過表達(dá)不促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，但在一定程度上減輕了壓力誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞分化抑制。

創(chuàng)傷性壓縮應(yīng)力通過抑制 Dancr 表達(dá)間接激活 NF-κB 信號(hào)通路 據(jù)報(bào)道，創(chuàng)傷性壓縮應(yīng)力會(huì)激活 NF-κB 信號(hào)通路，而這一發(fā)現(xiàn)再次得到驗(yàn)證。為了確定 Dancr 在調(diào)節(jié) NF-κB 信號(hào)通路中的作用，用 Dancr-siRNA 轉(zhuǎn)染細(xì)胞并用誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng) 5 天。蛋白質(zhì)印跡顯示，p-p65 和 p-IκBa 的表達(dá)顯著增加，而 IκBa 和 p65 的表達(dá)沒有顯著變化。

為了進(jìn)一步評(píng)估 Dancr 在壓力誘導(dǎo)的 NF-κB 信號(hào)激活中的作用，在 3 小時(shí)的壓縮力加載之前，用 Dancr 過表達(dá)質(zhì)粒和誘導(dǎo)培養(yǎng)基處理細(xì)胞 5 天。結(jié)果表明，Dancr 過表達(dá)組中 p-p65 和 p-IκBa 的表達(dá)較對(duì)照質(zhì)粒組明顯降低，但仍高于僅用 Dancr 過表達(dá)質(zhì)粒處理且無壓縮應(yīng)力處理的組。p65 的表達(dá)略有降低，而 IκBa 的表達(dá)沒有顯著變化，說明過表達(dá) Dancr 后，創(chuàng)傷應(yīng)激對(duì) NF-κB 信號(hào)通路的激活作用可以得到一定程度的抑制。上述結(jié)果表明，創(chuàng)傷應(yīng)激通過抑制 Dancr 表達(dá)間接激活了 NF-κB 信號(hào)通路。

該研究表明，創(chuàng)傷性壓縮應(yīng)力可以抑制 MC3T3-E 細(xì)胞上 Dancr 的表達(dá)，從而激活 NF-κB 信號(hào)通路，最終導(dǎo)致成骨分化受到抑制。

參考文獻(xiàn)：Lu Q, Xu W, Liu L, Zhou X, Ye L, Song D, Zhang L, Huang D. Traumatic compressive stress inhibits osteoblast differentiation through long chain non-coding RNA Dancr. J Periodontol. 2020 Nov;91(11):1532-1540. doi: 10.1002/JPER.19-0648. Epub 2020 Apr 18. PMID: 32160313.
文章來源：【http://www.naturethink.com/?news/217.html】

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