生物層干涉技術(shù)在中藥研究中的應(yīng)用

通過親和層析篩選與人參皂苷主要成分相互作用的蛋白，鑒定出14-3-3ζ蛋白為人參皂苷在腦組織中的潛在靶點(diǎn)。使用Octet®鑒定了20(S)- prototopanaxadiol (PPD，人參皂苷的代謝物)與14-3-3ζ 蛋白的直接相互作用（圖1）。14-3-3ζ蛋白-PPD復(fù)合物的共晶體結(jié)構(gòu)表明，14-3-3ζ蛋白的R56、R127和Y128氨基酸殘基參與與PPD互作，其中任何一個殘基突變都會導(dǎo)致PPD與14-3-3ζ蛋白的親和力顯著降低。該研究結(jié)果有助于更好地了解人參調(diào)節(jié)神經(jīng)元活性的作用機(jī)制，為基于人參皂苷結(jié)構(gòu)開發(fā)與14-3-3ζ結(jié)合的小分子化合物奠定基礎(chǔ)。 圖1. 上半部分為中藥新靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)與鑒定的技術(shù)路線：BLI（Octet®）主要用于鑒定靶點(diǎn)（14-3-3 ζ蛋白）與人參皂苷的結(jié)合；下半部分表格為靶點(diǎn)突變體與人參皂苷的親和力測定。

用靶點(diǎn)垂釣有效成分[3]
西南醫(yī)科大學(xué)

BLI生物層干涉技術(shù)與高分辨質(zhì)譜聯(lián)合使用，并以Aβ作為誘餌來垂釣中藥開心散（由遠(yuǎn)志、人參、茯苓和石菖蒲這4味中藥組成）中可以與Aβ相互結(jié)合的潛在小分子抑制劑。
1.將Aβ結(jié)合在Octet®傳感器上，然后將開心散提取液與傳感器上的Aβ進(jìn)行結(jié)合并解離；
2.將收集到的解離液應(yīng)用高分辨質(zhì)譜進(jìn)行分析并鑒定，發(fā)現(xiàn)去氫土莫酸（DTA）、豬苓酸C（PPAC）和土莫酸（TA）三個化合物與Aβ有著最強(qiáng)的結(jié)合力；
3.通過色譜分離制備出這三個化合物后，然后在AD的細(xì)胞和線蟲模型上對這些化合物的抑制Aβ纖維形成的活性進(jìn)行了評價；
4.研究發(fā)現(xiàn)，這些化合物在體內(nèi)外均有很好的抑制Aβ纖維形成的活性（圖2）： 圖2. 純化的TA與Aβ的親和力檢測

天然產(chǎn)物構(gòu)效關(guān)系研究[4]
中國藥科大學(xué)

CDC37是一種新的腫瘤治療靶點(diǎn)，天然產(chǎn)物雷公藤紅素（celastrol）能夠很好的抑制該靶點(diǎn)活性�，F(xiàn)在從celastrol的基本結(jié)構(gòu)（三萜）出發(fā)，合成了一系列化合物，用Octet®測定了所有化合物與藥物靶點(diǎn)CDC37相互作用。

1#化合物替換了A環(huán)的酮基，11#化合物改變了A環(huán)的羥基極性，BLI親和力測試發(fā)現(xiàn)，1#的親和力為90 μM，而11#化合物則無法與蛋白結(jié)合。說明A環(huán)的羥基極性對保持其活性是非常重要的（圖3）。
  圖3. 左邊為Octet® Red 96測定的Celastrol衍生物與CDC37的親和力，右邊為根據(jù)BLI結(jié)果得出的化合物構(gòu)效關(guān)系

天然化合物庫篩選和小分子競爭實驗[5]
澳門科技大學(xué)

基于分子對接并結(jié)合Octet®互作儀在天然化合物中篩選潛在SARS-CoV-2抑制劑。一些天然化合物抑制SARS-CoV-2誘導(dǎo)的Vero E6細(xì)胞的病變效應(yīng)和斑塊形成，使其喪失明顯的動物毒性并具有SARS-CoV-2假病毒突變體（D614G、N501Y、N439K和Y453F）的抗病毒效果。通過Octet®還發(fā)現(xiàn)，一些天然產(chǎn)物，比如EGCG、Bkc和Ibvc還與ACE2受體結(jié)合，體現(xiàn)與RBD和ACE2雙重結(jié)合。Octet®還可以進(jìn)行小分子之間的競爭實驗，對小分子在蛋白靶點(diǎn)上的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行分組（圖4）。 與RBD結(jié)合的一系列天然化合物 圖4. Octet®小分子競爭實驗:綠色為相互不競爭，紅色為相互競爭

BLI 技術(shù)在中藥開發(fā)及研究領(lǐng)域的應(yīng)用優(yōu)勢：

●節(jié)約樣品：只需要μg級的蛋白量和μM級的小分子量；
●避免損失：沒有復(fù)雜的流路系統(tǒng)，也沒有泵和進(jìn)樣系統(tǒng)，減少樣品的損失；
●經(jīng)濟(jì)高效：實驗后還可將剩余樣品進(jìn)行回收，減少了前期純化樣品的工作量；
●快速便捷：耗時短，同時可以檢測多種樣品，實時監(jiān)控檢測結(jié)果，在前期中藥篩選階段，可以提高效率，節(jié)約寶貴時間。

BLI 技術(shù)被廣泛應(yīng)用于中藥研究中，成為中藥分子機(jī)制研究的主流技術(shù)，為中醫(yī)藥走向世界提供有力的支持與保障。

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