斑馬魚呼吸代謝及行為分析技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用

      斑馬魚作為一種模式動(dòng)物，與人類共享高達(dá) 70% 的基因組，保留了多達(dá) 80% 的人類疾病相關(guān)蛋白。同樣作為一種脊椎動(dòng)物，斑馬魚與人類的組織和發(fā)育生物學(xué)過程相似，故而針對(duì)各種癌癥、肝病、血液疾病、心臟病和行為障礙的斑馬魚模型被建立起來，斑馬魚進(jìn)而成為了基因表達(dá)調(diào)控、發(fā)病機(jī)理、藥物篩選領(lǐng)域的主要模式動(dòng)物，在生物醫(yī)學(xué)研究的地位越來越重要(Patton et al., 2021)。       北京易科泰提供生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域斑馬魚呼吸代謝及行為分析的全套技術(shù)方案，包括斑馬魚成魚和魚卵、胚胎、幼魚的呼吸代謝測(cè)量、斑馬魚視頻跟蹤和行為分析及游泳能力評(píng)估。具體測(cè)量參數(shù)及應(yīng)用方向如下：
 

模塊	功能	關(guān)鍵參數(shù)	應(yīng)用方向
成魚呼吸代謝測(cè)量	4通道/8通道、自動(dòng)長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)	耗氧率（MO2/VO2)、 標(biāo)準(zhǔn)代謝率SMR	人類疾病研究：肥胖、2型糖尿病等代謝性疾病、 運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元相關(guān)疾病、心肌病等； 微量元素營養(yǎng)等
魚卵、胚胎、幼魚高通量呼吸代謝測(cè)量	24+通道高通量測(cè)量	耗氧率（MO2/VO2)
高通量視頻跟蹤及行為分析	24+通道高通量分析	速度、活動(dòng)/非活動(dòng)時(shí)間和比例、運(yùn)動(dòng)軌跡、 不同類型游泳行為統(tǒng)計(jì)
游泳能力	自動(dòng)化測(cè)量、分析 游泳訓(xùn)練	臨界游泳速度Ucrit
身體適應(yīng)力（physical fitness）評(píng)價(jià)	自動(dòng)化測(cè)量、分析 游泳訓(xùn)練	臨界游泳速度Ucrit、耗氧率（MO2/VO2) 活動(dòng)代謝率（AMR）

模塊1.成魚呼吸代謝測(cè)量

      斑馬魚幼魚及成魚呼吸代謝測(cè)量系統(tǒng)采用了經(jīng)典的間歇式(Intermittent flow/stop-flow)測(cè)量法，兼具高時(shí)間分辨率和長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)的特點(diǎn)。針對(duì)斑馬魚體長(zhǎng)短、體重輕、耗氧量低等特點(diǎn)，采用了小型的呼吸室、水泵及非接觸式的光學(xué)氧氣傳感器，確保獲得可靠的耗氧曲線和耗氧率數(shù)據(jù)。系統(tǒng)具備自動(dòng)控制、測(cè)量和分析的功能，放入斑馬魚樣品、設(shè)置間歇測(cè)量各階段的時(shí)間后，系統(tǒng)即可自動(dòng)運(yùn)行和計(jì)算耗氧率，研究人員也可借助配套軟件計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)代謝率(SMR)等數(shù)據(jù)。       易科泰公司提供同時(shí)自主集成的斑馬魚呼吸測(cè)量系統(tǒng)，可自動(dòng)切換小型水泵的開閉狀態(tài)，實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化間歇式測(cè)量。溶解氧監(jiān)測(cè)采用了熒光光纖氧氣傳感器，具備高靈敏度和高分辨率，并且易安裝、零維護(hù)。
 
模塊2. 魚卵、胚胎、幼魚高通量呼吸代謝測(cè)量

      斑馬魚魚卵、胚胎、幼魚呼吸代謝測(cè)量由內(nèi)置氧氣感應(yīng)貼片的24孔板、氧氣測(cè)量主機(jī)、密封配件等組成，多個(gè)氧氣測(cè)量主機(jī)可串聯(lián)組成最多240個(gè)通道的高通量測(cè)量系統(tǒng)。
應(yīng)用案例

      因與哺乳動(dòng)物具有功能相似的肝臟細(xì)胞和與人類相似的脂質(zhì)代謝，斑馬魚是研究肝病的有效模型。南卡羅萊納醫(yī)科大學(xué)的研究人員在KDSR（3-酮-二氫鞘氨醇還原酶）突變體斑馬魚中發(fā)現(xiàn)了肝病表型過程，并對(duì)其發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了研究。發(fā)現(xiàn)KDSR缺失導(dǎo)致鞘脂補(bǔ)救途徑的代償性激活和磷酸鞘氨醇(S1P)的積累，進(jìn)而導(dǎo)致線粒體活性增加、氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激以及隨之而來的肝細(xì)胞損傷。因此KDSR可能是一種新的脂肪變性和肝損傷的遺傳風(fēng)險(xiǎn)因子(Park et al., 2019)。

      該研究中的耗氧實(shí)驗(yàn)便采用了斑馬魚魚卵、胚胎、幼魚呼吸代謝測(cè)量系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了幼魚耗氧率的高通量、快速測(cè)定。先在24孔板的每個(gè)孔加入125μL的卵水，在24℃下運(yùn)行20min，之后放入3條幼魚，立即使用封口膜密封和硅膠墊壓實(shí)。使用配套軟件記錄，每3min記錄一次溶解氧濃度，持續(xù)30min。根據(jù)溶解氧濃度隨時(shí)間的變化計(jì)算了耗氧率，下圖展示了對(duì)照組和突變體各3條幼魚的7次測(cè)量結(jié)果。發(fā)現(xiàn)相比于對(duì)照組斑馬魚，KDSR突變體的耗氧率有所升高，該結(jié)果支持KDSR突變體線粒體β-氧化增強(qiáng)的結(jié)論。
模塊3. 高通量視頻跟蹤及行為分析

      斑馬魚視頻跟蹤和行為分析系統(tǒng)由高清高幀頻工業(yè)相機(jī)、斑馬魚行為分析軟件、斑馬魚活動(dòng)室/池等組成。先錄制高質(zhì)量斑馬魚活動(dòng)視頻，再在計(jì)算機(jī)上使用專業(yè)行為分析軟件對(duì)視頻中的斑馬魚進(jìn)行分析，獲得其隨時(shí)間變化的行為軌跡（X坐標(biāo)和Y坐標(biāo)；單條斑馬魚可做3D跟蹤，包括X、Y、Z坐標(biāo)），最后自動(dòng)計(jì)算獲得數(shù)十種行為學(xué)參數(shù)。基于機(jī)器視覺的斑馬魚行為分析系統(tǒng)，能夠?qū)?4孔、48孔、96孔板中的斑馬魚進(jìn)行高通量行為采集和分析，使研究者輕松獲得大量行為數(shù)據(jù)。
應(yīng)用案例
 
模塊4. 游泳能力

      l 斑馬魚游泳能力研究測(cè)試系統(tǒng)為一站式方案，包括斑馬魚專用小型游泳室和自動(dòng)化水流速度控制、校準(zhǔn)的所有軟硬件。系統(tǒng)提供適合斑馬魚游泳匹配的高精度控制水流，水流調(diào)節(jié)速度為0.7 - 50 cm/s。
      該系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)水流速度的校準(zhǔn)、轉(zhuǎn)換、校正和控制，單位和方式任選（如以BL/sec為單位的游泳速度），可對(duì)Solid Blocking效應(yīng)（斑馬魚自身阻礙水流引起的水流速度變化）進(jìn)行校正，并且能夠創(chuàng)建自動(dòng)化的用戶自定義程序。
應(yīng)用案例         上述測(cè)量結(jié)果顯示突變體的游泳能力相比于同齡野生型顯著降低，并且突變斑馬魚在大約7個(gè)月大時(shí)開始死亡，與同齡野生型對(duì)照魚相比，其存活率顯著下降。該結(jié)果支持GATAD1是DCM誘發(fā)基因的結(jié)論。
 
模塊5. 身體適應(yīng)力（physical fitness）評(píng)價(jià)

      斑馬魚身體適應(yīng)力（physical fitness）評(píng)價(jià)系統(tǒng)將游泳能力研究測(cè)試功能和呼吸代謝測(cè)量功能相結(jié)合，通過測(cè)定游泳速度-耗氧率的變化曲線評(píng)估斑馬的體力和身體適應(yīng)性。
 
應(yīng)用案例
   
參考論文