Minibox平行生物反應器在提高菌株生產魯棒性研究上的應用
微生物產業(yè)是國家戰(zhàn)略性新興產業(yè)。國家發(fā)展改革委于5月10日發(fā)布了《“十四五”生物經濟發(fā)展規(guī)劃》，明確了生物經濟發(fā)展的具體任務是推動生物燃料與生物化工融合發(fā)展。
圖片來源：【國家發(fā)展改革委舉行新聞發(fā)布會 介紹“十四五”生物經濟發(fā)展規(guī)劃有關情況】-國家發(fā)展和改革委員會 (ndrc.gov.cn)
美國制定了《生物質技術路線圖》（2002年），計劃到2030年，生物基產品替代有機化學品的比例達到25%，生物能源替代運輸用石油燃料的比例達到20%，相關產品絕大部分來自微生物制造；基于微生物生產化學品和燃料的產業(yè)正不斷增長，并且在全球經濟中發(fā)揮著越來越重要的作用，其在美國就占到了國民生產總值（GDP）的2%以上。
然而，微生物在工業(yè)生產過程中會遭遇到多種逆境壓力，例如高溫、低溫、酸、氧化、滲透壓力或者營養(yǎng)缺乏，會影響細胞生長和生產能力，導致減產。比如在氨基酸或有機酸生產中，酸性代謝物在發(fā)酵培養(yǎng)基中的逐漸積累會使菌株遭受酸壓力。盡管可以通過在培養(yǎng)基中添加堿性物質來減少酸壓力產生的負面影響，但同時也將增加下游分離成本、廢水和固廢的排放。
細胞對環(huán)境壓力的耐受性改造工程一直是生物制造業(yè)需要解決的關鍵問題。因此，科學家們提出對耐酸菌株的設計和篩選將會是一種更智能和更具成本效益的解決方案。雖然合成生物學理論上為設計這種耐受菌株提供了多種基因組進化策略，但難以從數百個與壓力相關的基因中選擇出少數關鍵基因，組裝成有效的抗逆模塊。近期，在《Microbial Cell Factories》雜志上發(fā)表的文章“Synthetic acid stress-tolerance modules improve growth robustness and lysine productivity of industrial Escherichia coli in fermentation at low pH ”中，華南理工大學聯合中糧營養(yǎng)與健康研究院、上海交通大學研究團隊巧妙地設計了一組合成抗酸模塊，通過微調少數基因的表達量即可有效提高菌株的酸耐受性。該模塊由質子消耗系統(tǒng)基因（gadE），蛋白質保護與質量控制系統(tǒng)基因（hdeB）和抗氧化酶系統(tǒng)基因（sodB和katE）組成，并通過酸響應啟動子進行調控。
首先，研究者們使用定向進化的方法，對酸響應性酸性休克RNA（asr）的啟動子進行改造，構建酸響應性asr啟動子突變庫，基于熒光蛋白的表達進行篩選獲得49個不同強度的酸響應asr啟動子。從中選擇四種變體具有不同強度的啟動子突變體以實現基因的適量表達，從而構建一系列的合成抗酸模塊。
asr啟動子突變庫pH響應比率大于1.8的啟動子在pH 7.0或pH 5.0 LBG的相對強度及對應的pH響應比率。
進一步，為了研究所選基因在中度酸性（pH 5.0）環(huán)境下對大腸桿菌耐酸性的影響，分別對gadE、hdeB、sodB、katE和katE-sodB進行單獨過表達的酸生長測試（如下所示）。接著，在4種不同強度的asr啟動子突變體P24E8、P10G6、P77C4和P50G1的控制下，組裝4個基因gadE、hdeB、sodB、katE構建合成抗酸模塊。
為了評估合成抗酸模塊是否能提高工業(yè)大腸桿菌的生產性能，研究者建立了大腸桿菌抗酸模塊逐級評估方法，對合成抗酸模塊進行從實驗室菌株、實驗室培養(yǎng)基到工業(yè)生產菌株、工業(yè)培養(yǎng)基條件下的性能評估。首先使用實驗室測試菌株E. coli MG1655在微孔板中（一次可測試200個樣）進行生長測試，然后使用工業(yè)賴氨酸生產菌株E. coli MG1655 SCEcL3在10-mL微生物反應器中（一次可測試24個樣）進行微型發(fā)酵篩選測試。
10ml微生物反應器中合成耐酸模塊對賴氨酸滴度的影響
最后在1.3-L x 8組的平行生物反應器（Minibox，T&J 迪必爾生物工程（上海）有限公司）中測試合成抗酸模塊對賴氨酸生產性能的影響。在Minibox 1.3-L x 8組的平行生物反應器培養(yǎng)過程中，首先將細胞在種子培養(yǎng)基中活化，以1%（v / v）接種量接種到含有100 mL種子培養(yǎng)基的500 mL搖瓶中，在搖床中37°C、250 rpm培養(yǎng)到OD600為2.0-3.0，然后將75 mL種子液接種到含425 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的1.3-L平行生物反應器中。在線監(jiān)測DO、pH和溫度。通過流加5%（w / v）氨水將培養(yǎng)基的pH值控制在6.8或6.0。在48 h發(fā)酵期間，DO、溫度和葡萄糖分別控制在40-60%，37.0 ± 0.1°C和0.4-1.0%（w / v）。并通過調節(jié)攪拌速率從200到1000 rpm進行控制，通氣速率為0.5 vvm。定期采集樣品以測量光密度，殘留葡萄糖和賴氨酸產量。
1.3-L平行生物反應器水平上，合成抗酸模塊對賴氨酸發(fā)酵中生產性能的影響
T&J 迪必爾生物Minibox 1.3-L平行生物反應器
使用Minibox平行反應器大大加速了研發(fā)進程，最終篩選得到能最大提高菌株生產性能的合成抗酸模塊，使工程菌株在pH 6.0下的產量與pH 6.8下的親本菌株產量和糖酸轉化率相當，菌株耐酸性能得到提高。
該研究構建了酸響應啟動子庫，構建了含有限4個基因構成的合成抗酸模塊，并發(fā)展了抗酸模塊逐級評估方法，實現了賴氨酸工業(yè)生產菌株耐酸性能的有效提升（耐受pH值下降1個單位），為提高工業(yè)微生物抗逆性的研究提供了新的思路，并且豐富了合成生物學元器件庫。
參考文獻：
1. Yao, X., Liu, P., Chen, B. et al. Syntheticacid stress-tolerance modules improve growth robustness and lysine productivityof industrial Escherichia coli in fermentation at lowpH. Microb Cell Fact 21, 68 (2022).https://doi.org/10.1186/s12934-022-01795-4
圖片來源：【國家發(fā)展改革委舉行新聞發(fā)布會 介紹“十四五”生物經濟發(fā)展規(guī)劃有關情況】-國家發(fā)展和改革委員會 (ndrc.gov.cn)
美國制定了《生物質技術路線圖》（2002年），計劃到2030年，生物基產品替代有機化學品的比例達到25%，生物能源替代運輸用石油燃料的比例達到20%，相關產品絕大部分來自微生物制造；基于微生物生產化學品和燃料的產業(yè)正不斷增長，并且在全球經濟中發(fā)揮著越來越重要的作用，其在美國就占到了國民生產總值（GDP）的2%以上。
然而，微生物在工業(yè)生產過程中會遭遇到多種逆境壓力，例如高溫、低溫、酸、氧化、滲透壓力或者營養(yǎng)缺乏，會影響細胞生長和生產能力，導致減產。比如在氨基酸或有機酸生產中，酸性代謝物在發(fā)酵培養(yǎng)基中的逐漸積累會使菌株遭受酸壓力。盡管可以通過在培養(yǎng)基中添加堿性物質來減少酸壓力產生的負面影響，但同時也將增加下游分離成本、廢水和固廢的排放。
細胞對環(huán)境壓力的耐受性改造工程一直是生物制造業(yè)需要解決的關鍵問題。因此，科學家們提出對耐酸菌株的設計和篩選將會是一種更智能和更具成本效益的解決方案。雖然合成生物學理論上為設計這種耐受菌株提供了多種基因組進化策略，但難以從數百個與壓力相關的基因中選擇出少數關鍵基因，組裝成有效的抗逆模塊。近期，在《Microbial Cell Factories》雜志上發(fā)表的文章“Synthetic acid stress-tolerance modules improve growth robustness and lysine productivity of industrial Escherichia coli in fermentation at low pH ”中，華南理工大學聯合中糧營養(yǎng)與健康研究院、上海交通大學研究團隊巧妙地設計了一組合成抗酸模塊，通過微調少數基因的表達量即可有效提高菌株的酸耐受性。該模塊由質子消耗系統(tǒng)基因（gadE），蛋白質保護與質量控制系統(tǒng)基因（hdeB）和抗氧化酶系統(tǒng)基因（sodB和katE）組成，并通過酸響應啟動子進行調控。
首先，研究者們使用定向進化的方法，對酸響應性酸性休克RNA（asr）的啟動子進行改造，構建酸響應性asr啟動子突變庫，基于熒光蛋白的表達進行篩選獲得49個不同強度的酸響應asr啟動子。從中選擇四種變體具有不同強度的啟動子突變體以實現基因的適量表達，從而構建一系列的合成抗酸模塊。
asr啟動子突變庫pH響應比率大于1.8的啟動子在pH 7.0或pH 5.0 LBG的相對強度及對應的pH響應比率。
進一步，為了研究所選基因在中度酸性（pH 5.0）環(huán)境下對大腸桿菌耐酸性的影響，分別對gadE、hdeB、sodB、katE和katE-sodB進行單獨過表達的酸生長測試（如下所示）。接著，在4種不同強度的asr啟動子突變體P24E8、P10G6、P77C4和P50G1的控制下，組裝4個基因gadE、hdeB、sodB、katE構建合成抗酸模塊。
10ml微生物反應器中合成耐酸模塊對賴氨酸滴度的影響
最后在1.3-L x 8組的平行生物反應器（Minibox，T&J 迪必爾生物工程（上海）有限公司）中測試合成抗酸模塊對賴氨酸生產性能的影響。在Minibox 1.3-L x 8組的平行生物反應器培養(yǎng)過程中，首先將細胞在種子培養(yǎng)基中活化，以1%（v / v）接種量接種到含有100 mL種子培養(yǎng)基的500 mL搖瓶中，在搖床中37°C、250 rpm培養(yǎng)到OD600為2.0-3.0，然后將75 mL種子液接種到含425 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的1.3-L平行生物反應器中。在線監(jiān)測DO、pH和溫度。通過流加5%（w / v）氨水將培養(yǎng)基的pH值控制在6.8或6.0。在48 h發(fā)酵期間，DO、溫度和葡萄糖分別控制在40-60%，37.0 ± 0.1°C和0.4-1.0%（w / v）。并通過調節(jié)攪拌速率從200到1000 rpm進行控制，通氣速率為0.5 vvm。定期采集樣品以測量光密度，殘留葡萄糖和賴氨酸產量。
1.3-L平行生物反應器水平上，合成抗酸模塊對賴氨酸發(fā)酵中生產性能的影響
T&J 迪必爾生物Minibox 1.3-L平行生物反應器
使用Minibox平行反應器大大加速了研發(fā)進程，最終篩選得到能最大提高菌株生產性能的合成抗酸模塊，使工程菌株在pH 6.0下的產量與pH 6.8下的親本菌株產量和糖酸轉化率相當，菌株耐酸性能得到提高。
該研究構建了酸響應啟動子庫，構建了含有限4個基因構成的合成抗酸模塊，并發(fā)展了抗酸模塊逐級評估方法，實現了賴氨酸工業(yè)生產菌株耐酸性能的有效提升（耐受pH值下降1個單位），為提高工業(yè)微生物抗逆性的研究提供了新的思路，并且豐富了合成生物學元器件庫。
參考文獻：
1. Yao, X., Liu, P., Chen, B. et al. Syntheticacid stress-tolerance modules improve growth robustness and lysine productivityof industrial Escherichia coli in fermentation at lowpH. Microb Cell Fact 21, 68 (2022).https://doi.org/10.1186/s12934-022-01795-4
標簽：
生物能源
