平行生物反應(yīng)器助力釀酒酵母細(xì)胞工廠高效合成人參皂苷

人參皂苷是名貴中藥材人參中的關(guān)鍵活性物質(zhì)，其中人參皂苷Rh2（ginsenoside Rh2）在多項(xiàng)研究中被發(fā)現(xiàn)具有誘導(dǎo)癌癥細(xì)胞凋亡和抑制癌癥細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等活性，是有希望能被應(yīng)用到癌癥預(yù)防和治療的天然活性物質(zhì)。但人參藥材中人參皂苷Rh2含量極低，不到干重的0.01%，為其商業(yè)化利用提出了挑戰(zhàn)。

中國(guó)科學(xué)院分子植物科學(xué)卓越創(chuàng)新中心/植物生理生態(tài)研究所合成生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室發(fā)表在《Cell Discovery》題為Synthesizing ginsenoside Rh2 in Saccharomyces cerevisiae cell factory at high-efficiency的研究論文，利用合成生物學(xué)方法高效合成人參皂苷Rh2。
   
該研究團(tuán)隊(duì)在之前的研究中曾開(kāi)發(fā)過(guò)一個(gè)酵母細(xì)胞工廠，利用該工廠從葡萄糖開(kāi)始生產(chǎn)人參皂苷Rh2。但由于原人參二醇（PPD）的供應(yīng)量低，并且關(guān)鍵的UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶（UGT）在生物合成途徑的最后一步中表現(xiàn)不佳，人參皂苷Rh2產(chǎn)量對(duì)于商業(yè)化需求而言太低。
   
在最新的研究中，針對(duì)第一代細(xì)胞工廠存在的問(wèn)題，進(jìn)一步通過(guò)甲羥戊酸通路的模塊化工程和P450表達(dá)水平的優(yōu)化構(gòu)建了PPD生產(chǎn)底盤(pán)。
   
進(jìn)一步，實(shí)驗(yàn)在10 L生物反應(yīng)器（迪必爾生物工程（上海）有限公司）中對(duì)生產(chǎn)PPD的底盤(pán)ZW04BY-RS進(jìn)行了補(bǔ)料分批發(fā)酵。發(fā)酵在144 h內(nèi)完成，最大生物量達(dá)到143.0 g/L干細(xì)胞重量（dcw）。補(bǔ)料分批發(fā)酵方式可以促進(jìn)高細(xì)胞密度，并已被證明可以增加工程酵母中天然產(chǎn)物的產(chǎn)生（如青蒿酸和丹參酮）。
發(fā)酵過(guò)程將約0.3 L菌株ZW04BY-RS或ZWDRH2-10種子接種到10L生物反應(yīng)器中的2.7 L培養(yǎng)基中發(fā)酵。發(fā)酵溫度設(shè)定在30°C，通過(guò)加入氫氧化銨將pH控制在5.0。溶解的氧通過(guò)改變攪拌速度或通氣量控制在30%以上。保持乙醇<0.5 g/L來(lái)控制進(jìn)料速率。最終，新的酵母底盤(pán)細(xì)胞在10L補(bǔ)料分批發(fā)酵中可產(chǎn)生11.02 g/L PPD。PPD干重含量為76.9 mg/g dcw（即酵母干重的7.7%），遠(yuǎn)高于5年人參根的總皂苷含量（2-3%）。  
基于這種高PPD生產(chǎn)底盤(pán)細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)建立了一系列細(xì)胞工廠來(lái)生產(chǎn)人參皂苷Rh2，并通過(guò)提高C3-OH糖基化效率進(jìn)行了優(yōu)化。再增加了UGTPg45的拷貝數(shù)，并設(shè)計(jì)了其啟動(dòng)子以提高表達(dá)水平。
 
進(jìn)一步，實(shí)驗(yàn)還篩選了來(lái)自UGTPg45直接演化的更有效和兼容的UGT生物部件。結(jié)合所有策略，最終建立了一個(gè)酵母細(xì)胞工廠，擁有目前為止最大的人參皂苷Rh2產(chǎn)量（10L分批補(bǔ)料發(fā)酵產(chǎn)量為2.25 g / L）。
   
研究結(jié)果為改善酵母細(xì)胞工廠以生產(chǎn)植物稀有天然產(chǎn)物，特別是糖基化產(chǎn)物樹(shù)立了一個(gè)成功的案例。
 
參考文獻(xiàn)：
1. Wang, P., Wei, W., Ye, W. et al. Synthesizing ginsenoside Rh2 in Saccharomyces cerevisiae cell factory at high-efficiency. Cell Discov 5, 5 (2019). https://doi.org/10.1038/s41421-018-0075-5