高通量菌落篩選工作站ROTOR+在深入研究新冠病毒中的應用

新型冠狀病毒肺炎疫情已經(jīng)在全球肆虐兩年。兩年間，奪去了數(shù)萬條生命，讓無數(shù)家庭失去親人，讓人們的生活支離破碎的病毒，還在不斷地繁衍和變化。

COVID-19是由SARS-CoV-2冠狀病毒感染引起的呼吸系統(tǒng)綜合征，在世界范圍內(nèi)已造成超過120萬人死亡，給許多國家醫(yī)療設施造成了巨大的壓力，并在世界范圍內(nèi)造成了重大的經(jīng)濟影響。SARS-CoV-2病毒是一種人畜共患冠狀病毒，可以通過呼吸道飛沫和氣溶膠迅速傳播。在過去20年里，由冠狀病毒引起的另外兩種主要呼吸綜合征，SARS和MERS也相繼出現(xiàn)。因此，新型冠狀病毒感染有可能會持續(xù)威脅人類健康。



冠狀病毒是巢狀病毒目中的包膜正鏈RNA病毒。所有冠狀病毒都含有一種通過包膜的刺突蛋白，它對宿主受體結(jié)合和感染非常重要，并使這些病毒在電子顯微照片中呈現(xiàn)冠狀外觀。冠狀病毒包含的基因組是所有正鏈RNA病毒中最大的，約為30Kb，部分原因是它編碼了一種RNA外切酶，在基因組復制過程中起校對作用。病毒基因組的前三分之二被翻譯成兩個大的多聚蛋白，通過病毒編碼的蛋白酶作用加工成單個的非結(jié)構(gòu)蛋白。這些非結(jié)構(gòu)蛋白重組宿主的膜結(jié)構(gòu)，形成病毒復制酶。 

盡管在過去10個月里，通過大量的研究，我們對SARS-CoV-2病毒了解了很多，但要抗擊這種病毒以及可能出現(xiàn)的新型傳染性變異冠狀病毒，還需要研究更多。酵母可以作為一個靈活的實驗對象，幫助安全地研究新冠病毒。雖然在酵母中還沒有發(fā)現(xiàn)正鏈RNA病毒，但已經(jīng)有幾種正鏈RNA病毒復制系統(tǒng)建立起來，通過酵母啟動子表達病毒RNA。來自SARS-CoV-2的單個病毒蛋白也已在酵母中表達，以確定真核生物常見的遺傳相互作用。此外，病毒蛋白已在酵母中表達，作為一種鑒定病毒蛋白的酶活性以及評估這些活性抑制劑的一種方式。 



研究員使用Singer公司的高通量菌落篩選工作站（ROTOR+）篩選病毒-宿主基因相互作用的酵母基因損傷庫（yeast gene disruptionlibrary）。通過SPA（SelectivePloidy Ablation，一種高通量的質(zhì)粒轉(zhuǎn)移方法）酵母交配的方法，將表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到陣列酵母文庫。該方法依賴于供體菌株的所有16個酵母染色體，包含著絲粒近端反選標記(URA3)和GAL1基因的半乳糖誘導蛋白啟動子。在有絲分裂期間，這些菌株的半乳糖誘導表達和著絲粒功能破壞，導致染色體缺失。在單倍體環(huán)境下，這種菌株在半乳糖環(huán)境下生長時會死亡。在二倍體雜合的CEN標記的染色體中，半乳糖上生長導致CEN標記染色體和所有伴隨的遺傳信息的特異性丟失。因此，所有16條染色體的雜合二倍體可以簡單地在半乳糖上通過有絲分裂生長成為單倍體。



高通量菌落篩選工作站ROTOR+，可以使用SPA方法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到菌株庫中。用含有感興趣病毒基因的表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化SPA供體菌株，用st作為選擇標記。轉(zhuǎn)化株在營養(yǎng)缺失的培養(yǎng)基中生長過夜，然后在SingerPlusPlates™的YPD培養(yǎng)基上涂布，形成菌膜。兩種交配型的兼容酵母庫被點種在YPD上，兩套培養(yǎng)皿都生長過夜。接下來菌膜和文庫排列被點種在一起進行交配，在YPD上生長6-8小時以交配，然后點種在含有半乳糖作為碳源的亮氨酸缺失培養(yǎng)基上。平板在30°C半乳糖上孵育2天，以使供體菌株染色體不穩(wěn)定，然后點種在含有半乳糖和5-氟乳酸(5-FOA)的亮氨酸缺失培養(yǎng)基上，以反選仍然含有供體染色體的活性菌株。用Singer PhenoBooth+成像前，在5-FOA上孵育2-3天，進行單倍體生長。將含有病毒表達質(zhì)粒的菌落與空載體對照進行比較，以確定在酵母突變體文庫中的適應性。



ROTOR+允許試劑設置諸如基因缺失變異株采集、使用大規(guī)模二倍體基因陣列全套克隆酵母基因、表型和化學基因分析。RoToR 使用塑料板墊，支持液體點種至96/384孔板或以96、384、768、1536、3072和6144的密度點種至瓊脂板上。SPA篩選過程是高效的，因為它可以迅速交配轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，不需要孢子形成和單倍體選擇。全基因組掃描可以在六天內(nèi)完成。