正畸壓應(yīng)力促進(jìn)破骨細(xì)胞形成的機(jī)制研究

在正畸治療期間，對(duì)牙齒施加機(jī)械力，導(dǎo)致牙槽骨的持續(xù)重塑。破骨細(xì)胞在壓力側(cè)移除舊骨，而成骨細(xì)胞在張力側(cè)形成新骨。在機(jī)械力誘導(dǎo)的骨重塑過(guò)程中，細(xì)胞骨架發(fā)揮著重要作用，將機(jī)械信號(hào)轉(zhuǎn)化為化學(xué)信號(hào)，然后化學(xué)信號(hào)再轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞中，調(diào)節(jié)分化、增殖、遷移和其他細(xì)胞過(guò)程。
 

據(jù)報(bào)道，多種信號(hào)通路參與成骨細(xì)胞的機(jī)械信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，如磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、Jun 氨基末端激酶、粘著斑激酶和 STAT3/Girdin/Akt 通路。相比之下，破骨細(xì)胞中的機(jī)械信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制在很大程度上尚未探索，因?yàn)槠乒羌?xì)胞是分化細(xì)胞，壽命短，仍然沒(méi)有穩(wěn)定的破骨細(xì)胞系。NF-κB 受體激活劑配體（RANKL）對(duì)于破骨細(xì)胞前體細(xì)胞激活和分化為破骨細(xì)胞至關(guān)重要。然而，尚不清楚機(jī)械力如何調(diào)節(jié)信號(hào)通路以促進(jìn)破骨細(xì)胞前體細(xì)胞分化和融合成破骨細(xì)胞。
 

侵襲性偽足是一種富含肌動(dòng)蛋白的膜突出物，能夠介導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)的局灶降解，在腫瘤細(xì)胞侵襲遷移過(guò)程中發(fā)揮重要作用。在破骨細(xì)胞生成過(guò)程中，侵襲性偽足在破骨細(xì)胞融合中起關(guān)鍵作用，環(huán)狀侵襲偽足的形成和破骨細(xì)胞融合都依賴于 Tks5，這是一種具有 N 端 phox 同源結(jié)構(gòu)域（PX）的銜接蛋白，最初被確定為 Src 底物。
 

基于先前的研究，山東省口腔組織再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、山東大學(xué)口腔學(xué)院口腔正畸科、昆明醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔正畸科的聯(lián)合課題組曾假設(shè)正畸壓縮力可能促進(jìn)環(huán)狀侵襲性偽足的形成以及破骨細(xì)胞前體與成熟破骨細(xì)胞的細(xì)胞間融合。這項(xiàng)研究旨在檢驗(yàn)假設(shè)并探索正畸壓縮力促進(jìn)破骨細(xì)胞成熟的潛在信號(hào)機(jī)制。實(shí)驗(yàn)使用源自 Balb/c 小鼠的 RAW264.7 巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞系作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停�研究正畸壓縮力對(duì)這些細(xì)胞中侵襲性偽足形成和細(xì)胞-細(xì)胞融合的影響。
 

壓力促進(jìn)破骨細(xì)胞成熟和侵襲偽足的形成
 

抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色一直是鑒定破骨細(xì)胞的可靠方法，實(shí)驗(yàn)對(duì)受到壓應(yīng)力的 RAW264.7  細(xì)胞進(jìn)行了 TRAP 染色。與未暴露于壓應(yīng)力的 RAW264.7 細(xì)胞相比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，暴露于壓應(yīng)力的細(xì)胞中 TRAP 陽(yáng)性細(xì)胞的百分比顯著更高。這表明，壓應(yīng)力促進(jìn)破骨細(xì)胞的成熟。

 

此外檢測(cè)到，在受到壓應(yīng)力的 RAW264.7 細(xì)胞中形成了侵襲性偽足。用 Tks5 和 F-肌動(dòng)蛋白抗體進(jìn)行免疫染色顯示，在暴露于壓應(yīng)力下，Tks5 和 F-肌動(dòng)蛋白在 RAW264.7 細(xì)胞延伸的侵襲性偽足中積累，并融合了多個(gè)細(xì)胞。定量分析表明，暴露于壓應(yīng)力的 RAW264.7 細(xì)胞中具有環(huán)狀侵襲性偽足的細(xì)胞百分比顯著高于未施壓的細(xì)胞。這表明，壓應(yīng)力促進(jìn)了環(huán)狀侵襲性偽足的形成和細(xì)胞融合。


壓應(yīng)力上調(diào) Ets-1 和 Tks5 的表達(dá)，促進(jìn) Ets-1 在 RAW264.7 細(xì)胞中的激活

接下來(lái)研究了壓縮應(yīng)力促進(jìn)環(huán)狀侵襲性偽足形成和細(xì)胞融合的分子信號(hào)機(jī)制。因?yàn)?nbsp;Tks5 是侵襲性偽足形成的主要調(diào)節(jié)因子，實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了壓力對(duì) Tks5 表達(dá)的影響。

蛋白質(zhì)印跡分析顯示，與未施壓的細(xì)胞相比，在受到壓力的 RAW264.7 細(xì)胞中，Tks5 表達(dá)在蛋白質(zhì)水平上調(diào)。此外，RT-PCR 分析顯示，與未施壓的細(xì)胞相比，在受到壓力的 RAW264.7 細(xì)胞中，Tks5 表達(dá)在 mRNA 水平上調(diào)。這表明，壓力在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)了 Tks5 的表達(dá)。

為了確定負(fù)責(zé) Tks5 上調(diào)的潛在轉(zhuǎn)錄因子，隨后進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，并預(yù)測(cè) Ets-1 是驅(qū)動(dòng) Tks5 表達(dá)的候選轉(zhuǎn)錄因子。此外，先前的研究表明，壓縮力或剪切應(yīng)力誘導(dǎo) Ets-1 的上調(diào)和激活以調(diào)節(jié)基因表達(dá)。因此，檢查了壓力對(duì) Ets-1 的表達(dá)和激活（磷酸化）的影響。

蛋白質(zhì)印跡分析顯示，與未施壓的細(xì)胞相比，在受到壓應(yīng)力的 RAW264.7 細(xì)胞中，Ets-1 蛋白和在 Thr38 處磷酸化的 Ets-1 水平顯著增加。此外，PCR分析顯示，與未施壓的細(xì)胞相比，在受到壓應(yīng)力的RAW264.7細(xì)胞中，Ets- 1表達(dá)在mRNA水平上調(diào)。這表明，壓應(yīng)力激活 Ets-1 上調(diào) Tks5 表達(dá)。

 

Tks5 是 Ets-1 在 RAW264.7 細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)
 

為了確認(rèn)壓應(yīng)力激活 Ets-1 以上調(diào) Tks5 表達(dá)，實(shí)驗(yàn)用 Ets-1過(guò)表達(dá)載體或Ets-1 siRNA 轉(zhuǎn)染RAW 264.7細(xì)胞，以在蛋白質(zhì)和 mRNA 水平上過(guò)表達(dá)或敲低 Ets-1。實(shí)驗(yàn)制作了包含 Tks5 野生型啟動(dòng)子區(qū)域和突變啟動(dòng)子區(qū)域的報(bào)告構(gòu)建體，其中預(yù)測(cè)的 Ets-1 結(jié)合位點(diǎn)被刪除。

熒光素酶測(cè)定顯示 Ets-1過(guò)表達(dá)導(dǎo)致Tks5啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性顯著增加，但這可以通過(guò)刪除 RAW264.7 細(xì)胞中 Tks5 啟動(dòng)子中預(yù)測(cè)的 Ets-1 結(jié)合位點(diǎn)來(lái)消除。此外，暴露于壓應(yīng)力顯著增加了 Tks5 野生型啟動(dòng)子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄活性，但不增加突變啟動(dòng)子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄活性。然而，由壓應(yīng)力刺激的 Tks5 野生型啟動(dòng)子區(qū)域增加的轉(zhuǎn)錄活性被 RAW264.7 細(xì)胞中 Ets-1 的敲低消除。總之，這表明 Tks5 在基本條件和壓應(yīng)力條件下都是 RAW264.7 細(xì)胞中 Ets-1 的轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)。

 

壓應(yīng)力誘導(dǎo) Tks5 上調(diào)、侵襲性偽足形成和細(xì)胞融合依賴于 Ets-1
 

為了確認(rèn) Ets-1 對(duì)壓力誘導(dǎo)的 Tks5 上調(diào)、侵襲偽足形成和細(xì)胞融合至關(guān)重要，實(shí)驗(yàn)使用 Ets-1 shRNA 敲低 RAW264.7 細(xì)胞中的 Ets-1�；�于免疫染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，壓縮應(yīng)力顯著增加了具有環(huán)狀侵襲偽足的 RAW264.7 細(xì)胞的百分比，敲低 Ets-1 顯著抑制了 RAW264.7 細(xì)胞在基本條件下和在壓縮應(yīng)力條件下環(huán)狀侵襲偽足的形成。此外，Ets-1 的敲低顯著抑制了 TRAP + 破骨細(xì)胞樣 RAW264.7 細(xì)胞在基本條件和壓縮應(yīng)力條件下的融合。這些結(jié)果表明 Ets-1 介導(dǎo)了壓應(yīng)力對(duì) Tks5 上調(diào)、侵襲性偽足形成和破骨細(xì)胞融合的影響。

 

總之，該研究證明了 Ets-1 被壓縮應(yīng)力上調(diào)，并且在壓縮應(yīng)力介導(dǎo) Tks5 上調(diào)、侵襲性偽足形成和破骨細(xì)胞融合的作用中至關(guān)重要。研究結(jié)果為正畸治療期間破骨細(xì)胞成熟和融合的機(jī)制提供了新的見(jiàn)解。

 

圖1 壓縮應(yīng)力誘導(dǎo)破骨細(xì)胞侵襲偽足形成和細(xì)胞融合機(jī)制的示意圖。

 

這項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，壓縮力誘導(dǎo)了 Tks5 的上調(diào)，這可以解釋壓縮力如何促進(jìn)侵襲偽足的形成。基于這些發(fā)現(xiàn)提出了一個(gè)模型來(lái)解釋壓縮力如何促進(jìn)破骨細(xì)胞成熟和融合。壓縮力誘導(dǎo) Ets-1 上調(diào)并導(dǎo)致 Ets-1 在 Thr38 位點(diǎn)磷酸化，接下來(lái)激活的 Ets-1 進(jìn)入細(xì)胞核識(shí)別 Tks5 基因啟動(dòng)子區(qū)域中的 Ets-1 結(jié)合位點(diǎn)并驅(qū)動(dòng) Tks5 的轉(zhuǎn)錄，然后 Tks5 促進(jìn)侵襲性偽足的形成和破骨細(xì)胞前體的融合。

 

參考文獻(xiàn)：Wang Y, Zeng Z, Cheng Y, Zhao L, Yan Q, Qiu Y, Hu J, Guo J. Orthodontic compressive force modulates Ets-1/Tks5 pathway to promote the formation of circumferential invadopodia and the fusion of osteoclast precursors. J Cell Physiol. 2019 Aug;234(8):12685-12691. doi: 10.1002/jcp.27879. Epub 2018 Dec 6. PMID: 30523634.

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