Elispot在COVID-19新冠疫苗研發(fā)的應用

研究顯示：代謝紊亂與嚴重COVID-19的風險增加有關。

COVID-19患者血清中葡萄糖含量的增加與患有和未患有糖尿病的個體預后不良相關（Shen 等人，2020 年）。在細胞水平上，SARS-CoV-2 誘導宿主細胞代謝向受感染細胞中的糖酵解轉(zhuǎn)變，以及針對己糖激酶（糖酵解中的限速酶）的糖酵解抑制劑2-脫氧-D-葡萄糖 (2DG))，干擾結腸腺癌細胞 (Caco-2) 細胞和單核細胞中的 SARS-CoV-2 感染（Bojkova 等人，2020 年；Codo 等人，2020 年）。因此，拮抗病毒引起的宿主細胞代謝變化，尤其是糖酵解的藥物是COVID-19治療的候選藥物。

此次試驗采用的是Elispot技術（酶聯(lián)免疫斑點檢測法），并通過Bioreader®-7000-FzI (Bio-Sys) 對尖峰陽性區(qū)域進行定量。

ELISPOT之于疫苗開發(fā)

在新冠狀病毒肆虐的當下，國內(nèi)外針對新冠狀病毒的疫苗研發(fā)正爭分奪秒的進行，在疫苗效果評價中，有很多權威期刊文章中指出使用ELISPOT技術檢測疫苗的細胞免疫功能是重要的技術手段并已得到廣泛使用。
中國藥品生物制品檢定所在 2003年發(fā)布的《預防用以病毒為載體的活疫苗制劑的技術指標原則》中明確指明：“使用ELISPOT方法檢測淋巴細胞分泌γ干擾素功能，作為檢測和評價疫苗的細胞免疫的有效方法”。
此外，世界衛(wèi)生組織在艾滋病(HIV)疫苗的研究中，也推薦使用ELISPOT檢測淋巴細胞分泌γ干擾素功能（WHO-UNAIDS-sponsored training workshop 2003）。

ELISPOT（Enzyme-linked Immunospot Assay）全名為酶聯(lián)免疫斑點檢測，是利用預先包被好抗原或抗體的微量板從單細胞水平檢測特異性抗體分泌細胞或特異性細胞因子(cytokine,CK)分泌細胞的免疫學檢測技術。1983年，Sedgwick和 Czerkinsky 等根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)的基本原理結合細胞培養(yǎng)技術，建立并首先報道了這種新技術，用于檢測特異性抗體分泌細胞。1988 年該方法被首次用于檢測 IFN-γ分泌細胞。
簡單來說，就是用在PVDF 膜為底的孔板上包被好的抗體捕獲培養(yǎng)中的細胞分泌的細胞因子，并以酶聯(lián)斑點顯色的方式將其呈現(xiàn)出來。

ELISPOT技術的基本步驟為:

(1) 用抗待檢細胞因子的高親和力的單克隆抗體包被96孔板,然后用1%牛血清蛋白37℃封閉2 h, 阻止非特異性蛋白的吸附。

(2) 將細胞和刺激劑加到孔中孵育一段時間, 此時活化細胞分泌細胞因子。

(3) 洗去多余的細胞。

(4) 加入生物素標記的檢測抗體。

(5) 加入酶標記的鏈親和素, 加入底物溶液顯色檢測抗體細胞因子復合物。

數(shù)據(jù)檢測和分析

通過顯色反應，在細胞分泌可溶性蛋白的相應位置上顯現(xiàn)清晰可辨的斑點，可使用BIO-SYS Bioreader對斑點進行計數(shù)，進行高通量篩選，檢測效率遠遠高于其它方法。

關于BIO-SYS\Bioreader

由德國BIO-SYS有限公司研制，擁有專利的雙遠心照明系統(tǒng)，通過使用“光度”強度照明和梯度來區(qū)分真/假點。
 

實驗結果輸出：

參考文獻：

Bojkova D, Costa R, Reus P, Bechtel M, Jaboreck MC, Olmer R, Martin U, Ciesek S, Michaelis M, Cinatl J Jr. Targeting the Pentose Phosphate Pathway for SARS-CoV-2 Therapy. Metabolites. 2021 Oct 13;11(10):699. doi: 10.3390/metabo11100699. PMID: 34677415; PMCID: PMC8540749.