斑馬魚模型研究在抗帕金森癥靶向藥的應(yīng)用

帕金森病 (PD) 是最常見的運(yùn)動(dòng)障礙，全球約 500 萬人患有帕金森病。這種神經(jīng)退行性疾病的特征包括運(yùn)動(dòng)遲緩、靜止性震顫、姿勢(shì)不穩(wěn)和肌肉僵硬。雖然我們?nèi)晕赐耆�了解PD的原因，但黑質(zhì)中多巴胺能神經(jīng)元的退化是該疾病的主要病理特征。目前的藥物療法，例如左旋多巴（L-dopa）、多巴胺激動(dòng)劑、單胺氧化酶等，通過更換多巴胺或控制其新陳代謝來進(jìn)行對(duì)癥治療。雖然這些藥物大大提高了病人的生活質(zhì)量，但它們會(huì)隨著病情的發(fā)展逐漸失去功效，還會(huì)出現(xiàn)由左旋多巴引起的運(yùn)動(dòng)波動(dòng)和運(yùn)動(dòng)障礙。盡管大量新的抗帕金森的候選藥物在臨床前研究中取得初步成功，我們對(duì)于開發(fā)新的替代藥物的需求依舊不斷增長(zhǎng)。
 
斑馬魚因?yàn)轶w積小、透明度高、對(duì)化合物的滲透性高，特別適合大規(guī)模藥物篩選。此外，研究表明斑馬魚多巴胺能系統(tǒng)的組織和功能與哺乳脊椎動(dòng)物相比更加穩(wěn)定，這使得斑馬魚成為一種實(shí)用且經(jīng)濟(jì)的用于測(cè)試神經(jīng)活性化合物作用的動(dòng)物模型。當(dāng)斑馬魚幼魚被6-OHDA (6-羥基多巴胺) 影響后，會(huì)展現(xiàn)出典型的PD表型特征，即多巴胺能神經(jīng)元的死亡和運(yùn)動(dòng)遲緩。此外，6-OHDA 損傷的斑馬魚對(duì)抗帕金森病化合物有反應(yīng)，因此斑馬魚模型是極好的評(píng)估新療法的工具。
 
 
為緩解6-OHDA損傷的斑馬魚幼魚的運(yùn)動(dòng)障礙以及神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少的癥狀，本次實(shí)驗(yàn)主要探究三種抗帕金森癥的化合物L(fēng)-dopa, rasagiline 和 isradipine的作用。我們最終選用了stavudine, tapentadol 和 nabumetone作為帕金森癥的靶向藥。接下來和我們一起來了解實(shí)驗(yàn)過程和研究結(jié)果吧。
 
 
過程
本次實(shí)驗(yàn)針對(duì)測(cè)試治療控制進(jìn)行了優(yōu)化，使用了如圖1所示的劑量反應(yīng)曲線，將斑馬魚幼魚在受精后在胚胎培養(yǎng)基內(nèi)長(zhǎng)大至第四天，胚胎培養(yǎng)基包含（EM [5 mM NaCl、0.17 mM KCl、0.33 mM CaCl2、 0.33 mM MgSO4, pH 7.4]) 以及 1 μM 亞甲基。
在這個(gè)發(fā)育階段，斑馬魚兒茶素層能系統(tǒng)已完全發(fā)育，血腦屏障 (BBB) 也已經(jīng)開始發(fā)揮作用。斑馬魚幼魚在受精后的五天內(nèi)都處于6-OHDA 誘導(dǎo)的多巴胺能損傷環(huán)境中，讓神經(jīng)毒素完全滲透于血腦屏障。
在第六天根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組，不同的化合物會(huì)加入到幼魚的培養(yǎng)基液中并持續(xù)24小時(shí)。我們通過使用諾達(dá)思的斑馬魚行為軌跡跟蹤系統(tǒng)(DanioVision)來記錄幼魚的自發(fā)運(yùn)動(dòng)行為，斑馬魚行為軌跡跟蹤系統(tǒng)可以自動(dòng)跟蹤斑馬魚用于的行為及運(yùn)動(dòng)軌跡。幼魚可以在96孔板中自由游動(dòng)，在10分鐘的晝夜循環(huán)后會(huì)進(jìn)行90分鐘的跟蹤記錄。記錄下的運(yùn)動(dòng)軌跡數(shù)據(jù)通過諾達(dá)思的動(dòng)物運(yùn)動(dòng)軌跡跟蹤系統(tǒng)(EthoVision XT)進(jìn)行分析，并且只分析在黑暗期間的游泳行為。根據(jù)諾達(dá)思提供的實(shí)驗(yàn)規(guī)章，實(shí)驗(yàn)所測(cè)量和分析的數(shù)據(jù)包括總游動(dòng)距離(mm)、突發(fā)游泳行為 (游動(dòng)速度大于25mm/s的次數(shù)) 和靜止?fàn)顟B(tài)。

結(jié)果
結(jié)果1
L-dopa, rasagiline 和 isradipine可緩解斑馬魚幼魚運(yùn)動(dòng)遲緩
6-OHDA損傷的斑馬魚幼魚從移動(dòng)總距離的量化上表現(xiàn)出類似運(yùn)動(dòng)遲緩的行為，為了進(jìn)一步表現(xiàn)這種運(yùn)動(dòng)損傷，我們計(jì)算了幼魚達(dá)到逃跑行為的速度次數(shù)(>25mm/s)。這個(gè)參數(shù)可以評(píng)估運(yùn)動(dòng)適應(yīng)性。在暴露于6-OHDA兩天后受損幼魚與健康幼魚比，爆發(fā)游動(dòng)和總移動(dòng)距離都減少了(圖2)。我們還評(píng)估了在這個(gè)模型中L-dopa能否緩解運(yùn)動(dòng)損傷，為了確定有效劑量，將6-OHDA損傷的幼魚與不同濃度的每種化合物進(jìn)行接觸干預(yù)，并勾勒出了劑量反應(yīng)圖。如圖2。
 
結(jié)果2
Isradipine可以緩解多巴胺能細(xì)胞數(shù)量的減少
我們還探索了L-dopa, rasagiline和isradipine對(duì)神經(jīng)元損失緩解的特性。在用每種化合物以有效劑量干預(yù)幼魚后，分析幼魚行為，結(jié)果如圖3所示。Isradipine可以緩解6-OHDA損傷的幼魚多巴胺能細(xì)胞數(shù)量的減少。相反L-dopa和rasagiline并未在斑馬魚模型中呈現(xiàn)改善疾病的效果。
 
結(jié)果3
Isradipine 和 amantadine可以減少幼魚的運(yùn)動(dòng)障礙樣行為
同樣通過每種化合物以有效劑量干預(yù)幼魚后，分析幼魚行為得出，isradipine在0.06μM劑量和amantadine在25 μM劑量時(shí)，幼魚的運(yùn)動(dòng)障礙樣行為有所緩解。相反L-dopa則未起到作用，如圖4。
 
結(jié)果4
通過基于表型的篩選來識(shí)別具有抗帕金森病潛能的化合物
為了篩選出可以針對(duì)帕金森癥緩解運(yùn)動(dòng)障礙的化合物，我們對(duì)1600種FDA認(rèn)證的藥品進(jìn)行了表型測(cè)定。1600種FDA認(rèn)證的藥物中有258 (16%)種藥品在第一輪實(shí)驗(yàn)分析中可以緩解運(yùn)動(dòng)障礙 (Fig.5 Table1)，基于預(yù)先確定的排除標(biāo)準(zhǔn)再將這些藥物重新定位進(jìn)行篩選，83 種(32%)藥品被淘汰(Table2)。在第三輪和第四輪的篩選中，有78種(30%)和23種(29%)藥品可以相對(duì)來說緩解運(yùn)動(dòng)障礙(Table 1)。在經(jīng)過最后的分析之后，最終確定了三種：stavudine, tapentadol 和 nabumetone，作為最有效的可以用于未來研究抗帕金森靶向藥的藥品(Table 3)。  
 
 
 
參考文獻(xiàn)
Vaz, Rita L., et al. “Identification of Antiparkinsonian Drugs in the 6-Hydroxydopamine Zebrafish Model.” Pharmacology Biochemistry and Behavior, vol. 189, 2020, p. 172828., https://doi.org/10.1016/j.pbb.2019.172828.