細(xì)胞共培養(yǎng)促進(jìn)缺氧條件下骨橋蛋白的誘導(dǎo)

腎功能衰竭是一個(gè)重大的公共衛(wèi)生問(wèn)題，發(fā)病率每年都在增加。終末期腎病患者需要腎移植或血液透析才能維持生命。動(dòng)靜脈內(nèi)瘺（AVF）作為血液透析的血管通路。只有 50% 的 AVF 在創(chuàng)建六個(gè)月后仍保持功能，這增加了患者的發(fā)病率和死亡率。一些臨床因素似乎與 AVFs 功能障礙有關(guān)，包括性別、年齡或糖尿病。組織學(xué)上，功能障礙最常見(jiàn)的原因是內(nèi)膜增生（NH），它是狹窄的原因。在 AVF 的 NH 中已經(jīng)確定了不同的機(jī)制，包括成纖維細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞增殖和內(nèi)皮細(xì)胞活化。

越來(lái)越多的證據(jù)支持 HIF 通路對(duì)影響血管壁的疾�。ò�括動(dòng)脈粥樣硬化，動(dòng)脈瘤，肺動(dòng)脈高壓，血管移植失敗，慢性靜脈疾病和血管畸形）的發(fā)病機(jī)制的保護(hù)和破壞作用。此外，VEGF-A（一種 HIF-1α 靶基因）的表達(dá)增加可能通過(guò)增加平滑肌細(xì)胞的增殖而促成 NH。最近的一項(xiàng)研究表明，在 AVF 形成過(guò)程中降低 VEGF-A 基因表達(dá)會(huì)降低 NH。

骨橋蛋白（OPN）是一種 SIBLING 蛋白（小整合素結(jié)合配體 N 端連接糖蛋白），最初被鑒定為將骨細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)連接起來(lái)的骨基質(zhì)蛋白。OPN 有兩種亞型，即分泌型（sOPN）和胞內(nèi)型（iOPN），它們具有不同的生物學(xué)功能。OPN 參與多個(gè)過(guò)程，包括組織重塑、細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)、病理性慢性炎癥過(guò)程、癌變以及心血管疾病。特別是，已發(fā)現(xiàn)它在人再狹窄性血管病變和狹窄性血管病變的血管平滑肌細(xì)胞中表達(dá)。

活性氧（ROS）和高血糖在胰腺上皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞中誘導(dǎo) OPN 的體內(nèi)表達(dá)。盡管已顯示缺氧狀態(tài)時(shí) OPN 的上調(diào)依賴(lài)或獨(dú)立于 HIF-1 的調(diào)控，但 OPN 表達(dá)在缺氧條件下通過(guò)不同的機(jī)制增強(qiáng)，導(dǎo)致與 VEGF 共表達(dá)。

鑒于氧濃度的變化發(fā)生在 AVF 的手術(shù)創(chuàng)建過(guò)程中與 OPN 過(guò)表達(dá)同時(shí)發(fā)生，法國(guó)蔚藍(lán)海岸大學(xué)、法國(guó)尼斯大學(xué)中心醫(yī)院血管外科、摩納哥科學(xué)中心的課題組認(rèn)為 OPN 是由缺氧誘導(dǎo)的，因此可能由于 NH 和近端吻合口狹窄而導(dǎo)致 AVF 成熟失敗。他們假設(shè)通過(guò)沉默 HIF 或 NF-kB 來(lái)調(diào)節(jié) OPN 可以促進(jìn) AVF 成熟。最后還描述了一種體外共培養(yǎng)細(xì)胞模型，該模型在缺氧條件下誘導(dǎo) OPN，但僅在細(xì)胞-細(xì)胞相互作用的條件下。
 

在缺氧細(xì)胞中不誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi) OPN（iOPN）

首先，實(shí)驗(yàn)評(píng)估了 AVF 患者中 OPN 的表達(dá)水平。與對(duì)照靜脈相比，AVF 中 OPN mRNA 的表達(dá)和 OPN 免疫反應(yīng)性均顯著增加，證實(shí)了之前的結(jié)果以及 OPN 在 AVF 成熟中的潛在作用。

然后在不同的細(xì)胞模型中通過(guò)免疫印跡對(duì) iOPN 進(jìn)行表征。重組 OPN（recOPN）用于定量表達(dá)。人骨髓間充質(zhì)細(xì)胞成骨細(xì)胞和 LNCap 細(xì)胞作為對(duì)照進(jìn)行檢查，因?yàn)檫@兩個(gè)模型已知表達(dá) OPN。針對(duì) OPN 的抗體檢測(cè)到的 recOPN 濃度為 50 和 16.6 ng，相對(duì)分子量為 70 kDa。人骨髓間充質(zhì)細(xì)胞和成骨細(xì)胞在培養(yǎng) 48 小時(shí)后在常氧環(huán)境中顯示出 iOPN 的高表達(dá)。

由于 iOPN 在 LNCaP 中表達(dá)，評(píng)估了這些細(xì)胞中 iOPN 的潛在缺氧誘導(dǎo)，并觀察到了輕微的誘導(dǎo)。由于 HIF-1 是細(xì)胞適應(yīng)缺氧的關(guān)鍵蛋白，實(shí)驗(yàn)檢查了 HIF-1 是否參與 iOPN 的誘導(dǎo)。使用 siRNA 沉默 HIF-1α，發(fā)現(xiàn)在沒(méi)有 HIF-1α 的情況下，iOPN 表達(dá)仍然存在。只有 OPN 應(yīng)用 siRNA#2 完全消除了 iOPN 的表達(dá)。

隨后的實(shí)驗(yàn)是用這種 siRNA 對(duì) OPN 進(jìn)行的。NHF（代表外膜），HUVSMC（代表與彈性纖維相關(guān)的平滑肌細(xì)胞，對(duì)構(gòu)成動(dòng)脈和靜脈三層的三個(gè)細(xì)胞系進(jìn)行了 iOPN 表達(dá)測(cè)試。盡管在缺氧條件下（1% O2 48 小時(shí)）檢測(cè)到 HIF-1α 和 HIF-2α ，但這些細(xì)胞均未表達(dá) iOPN。這些細(xì)胞在常氧或缺氧的 0.2% O₂ 中均不表達(dá) iOPN。用siRNA 轉(zhuǎn)染 NHF、HUVSMC和 HUVEC、HIF-1α 和/或 HIF-2α 大大減少了這兩個(gè)亞基的數(shù)量，而 HIF-1α 的沉默略微增加了 HIF-2α 的檢測(cè)水平，反之亦然。因此沉默了兩個(gè)亞基來(lái)完全消除 HIF 的活性。

這些結(jié)果表明在 NHF 中，iOPN 表達(dá)低于 16.6 ng 的可檢測(cè)水平，而在 HUVSMC 和 HUVEC 中弱表達(dá)。

 

在缺氧細(xì)胞中不誘導(dǎo)分泌型 OPN（sOPN）

然后，實(shí)驗(yàn)使用 ELISA 測(cè)試了這些細(xì)胞中的 sOPN。使用兩種不同的試劑盒，一種以納克為單位測(cè)量 sOPN，一個(gè)以皮克為單位。當(dāng)使用 recOPN 作為參考時(shí)，在常氧或缺氧或 H₂O₂ 或葡萄糖等可能誘導(dǎo) OPN 的條件下在納克水平下 NHF、HUVSMC 和 HUVEC 中未檢測(cè)到 sOPN。

更靈敏的試劑盒檢測(cè)在 NHF 中、HUVSMC中檢測(cè)到 sOPN，但不在 HUVEC 。HNF 和 HUVSMC 在常氧環(huán)境中的 sOPN 水平相似，分別為 765 和 1060 pg/mL。SiRNA OPN（siOPN）用作對(duì)照，消除了 OPN 的分泌。然而，沒(méi)有已知的增加 OPN 的刺激物在常氧環(huán)境中激活 sOPN。缺氧條件不會(huì)增加 sOPN，并且 HIF-1α 和/或 HIF-2α 的沉默不會(huì)阻止 NHF 和 HUVSMC 中 OPN 的分泌。然而，用特異性抑制劑（IKK2（AS602868）抑制劑，iNF-κB ）會(huì)輕微抑制 NF-κB 活性，但在統(tǒng)計(jì)學(xué)上 OPN 的分泌從 850 pg/mL 降低到 700 pg/mL。

這些結(jié)果證實(shí)了兩種 iOPN 的弱表達(dá)和這些細(xì)胞中的 sOPN，并表明在 HUVEC 中未檢測(cè)到 sOPN。實(shí)驗(yàn)還證實(shí)，這兩種形式在缺氧條件下不會(huì)通過(guò) HIFs 誘導(dǎo)。然而表明 NF-κB 在一定程度上參與了 OPN 的調(diào)控。

 

共培養(yǎng)有利于缺氧條件下 OPN 的誘導(dǎo)

最后，鑒于 OPN 和 AVF 之間的潛在聯(lián)系已在小鼠模型的成熟過(guò)程早期顯示，其中三層細(xì)胞并列，實(shí)驗(yàn)使用不同的組合共培養(yǎng)細(xì)胞：NHF/HUVSMC、NHF/HUVEC、HUVSMC /HUVEC 和 NHF/HUVSMC/HUVEC。NHF、HUVSMC 和 HUVEC 中 OPN 的 mRNA 表達(dá)高于 NHF/HUVSMC、NHF/HUVEC、HUVSMC/HUVEC 和 NHF/HUVSMC/HUVEC 共培養(yǎng)物 。HUVSMC/HUVEC 的共培養(yǎng)明顯增加了 OPN 的表達(dá)水平。然后，與對(duì)照 siRNA 或 siOPN 相比，在 siRNA 不存在或存在的情況下量化了 OPN 在常氧和缺氧中的內(nèi)源性表達(dá)。暴露于缺氧的 NHF/HUVSMC 和 NHF/HUVEC 的共培養(yǎng)顯示 OPN 表達(dá)增加了兩倍。HUVSMC 和 HUVEC 的細(xì)胞間相互作用顯示出 OPN 的基礎(chǔ)表達(dá)量高，是其他缺氧共培養(yǎng)中 OPN 的 16 倍，而其他共培養(yǎng)物在缺氧時(shí)未發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)。最后，所有細(xì)胞類(lèi)型一起呈現(xiàn)中間表達(dá)，在常氧條件下四倍誘導(dǎo)，但在缺氧條件下仍然沒(méi)有誘導(dǎo)。

因此，使用 ELISA 測(cè)量了不同組合中的 sOPN。在所有共培養(yǎng)組合中，觀察到缺氧條件下 sOPN 的誘導(dǎo)。此外，與沒(méi)有 HUVEC（NHF/HUVSMC，1.5 倍誘導(dǎo)）的組合相比，HUVEC 與 NHF（2.3 倍誘導(dǎo)）、HUVSMC（2.7 倍誘導(dǎo)）或 NHF/HUVSMC（2.4 倍誘導(dǎo)）的組合似乎在缺氧時(shí)刺激更多的 sOPN 誘導(dǎo)（NHF） 。最后，發(fā)現(xiàn) OPN 下調(diào)不會(huì)改變 NHF、HUVSMC 和 HUVEC 的細(xì)胞增殖，而重組人 OPN 只會(huì)增加 HUVEC 增殖，表明 HUVEC 細(xì)胞對(duì) OPN 敏感并且可以直接促成病理性 NH 的發(fā)生。

這些結(jié)果強(qiáng)烈表明，在沒(méi)有細(xì)胞間相互作用的情況下，OPN 表達(dá)不會(huì)在缺氧條件下被誘導(dǎo)。此外，不表達(dá) OPN 的 HUVEC 細(xì)胞是 NH 過(guò)程的核心。

總之該研究表明，在 AVF 成熟期間發(fā)生的氧合變化可能通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞或至少通過(guò)形成 AVF 的不同細(xì)胞層的細(xì)胞間相互作用上調(diào) OPN 的分泌，進(jìn)而增加炎癥并促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖。

參考文獻(xiàn)：Sadaghianloo N, Contenti J, Dufies M, Parola J, Rouleau M, Lee S, Peyron JF, Fabbri L, Hassen-Khodja R, Pouysségur J, Bost F, Jean-Baptiste E, Dardik A, Mazure NM. Co-culture of human fibroblasts, smooth muscle and endothelial cells promotes osteopontin induction in hypoxia. J Cell Mol Med. 2020 Mar;24(5):2931-2941. doi: 10.1111/jcmm.14905. Epub 2020 Feb 7. PMID: 32032472; PMCID: PMC7077551.

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