傳染病疫苗開發(fā)中面臨的問題及解決方法

新發(fā)傳染病（emerging infectious diseases，EID）至少占所有人類病原體的 15%，比如流感病毒、埃博拉病毒、寨卡病毒、冠狀病毒（SARS/SARS-CoV-2）等，對公共衛(wèi)生構(gòu)成重大負擔^[1]。新冠病毒具備極強的感染能力，傳播能力和突變能力，對其如何進行有效地預防和控制以及治療成為全球面臨的問題。
疫苗接種是應對傳染病最成功的預防和控制的方式，然而疫苗的開發(fā)過程往往是漫長的，也是昂貴的^[2][3]。這就要求科學家們需要以極快的速度通過更新穎的方法來開發(fā)新的疫苗，來應對傳染病的爆發(fā)。

目前，針對新冠病毒已經(jīng)開發(fā)了如滅活疫苗、重組蛋白疫苗、腺病毒疫苗、mRNA疫苗等多種安全有效的疫苗。但仍然有許多挑戰(zhàn)需要克服，如下圖所示：
以上這些挑戰(zhàn)和面臨的問題在疫苗的研發(fā)生產(chǎn)的不同環(huán)節(jié)均有所體現(xiàn)：

●病原體的發(fā)現(xiàn)和表征
●患者的免疫反應特征
●疫苗的功能和有效性評估
●生產(chǎn)過程定量及質(zhì)控分析
賽多利斯生物分析產(chǎn)品 Octet®、Incucyte®和iQue®蛋白質(zhì)和細胞分析平臺為更快的疫苗發(fā)現(xiàn)、表征和開發(fā)提供創(chuàng)新的高通量和自動化解決方案，可輕松應對以上諸多挑戰(zhàn)，極大地簡化了工作流程，加快了研發(fā)進度。
下面陳老濕就通過幾個國內(nèi)外研究案例詳細介紹高通量生物分析技術(shù)在疫苗設計開發(fā)過程中的應用。
  病原體的發(fā)現(xiàn)和表征

2020年1月10日，中國疾病預防控制中心發(fā)布了SARS-CoV-2基因組的初始序列^[4]，并在2020 年 1 月 29日和2 月 3 日在線發(fā)布了完整的病毒基因組序列^[5]。基于其與SARS病毒的相似性，新冠病毒的棘突蛋白（S蛋白）成為研究的熱點和突破口之一。復旦大學的應天雷等人最早通過親和力實驗證明了SARS-CoV-2  S蛋白的RBD結(jié)構(gòu)域可與人的ACE2受體結(jié)合^[6]，親和力與報道的SARS的S-RBD和ACE2的親和力接近^[7]。 華盛頓大學的David Veesler等人通過結(jié)構(gòu)學分析來研究 S 蛋白的特性。SARS-CoV-2 S蛋白三聚體具有兩種結(jié)構(gòu)：50%三聚體的三個S蛋白都處于閉合位置，而50%的三聚體的一個 S 蛋白處于開放位置，另外兩個S 蛋白處于閉合位置。這些結(jié)構(gòu)細節(jié)可以幫助科學家設計阻止病毒S蛋白與宿主細胞ACE2 受體結(jié)合的抑制劑。此外，Octet®檢測顯示，SARS-CoV-2和SARS-CoV的S蛋白與 ACE2 具有相似的親和力和結(jié)合速率，但是SARS-CoV-2的解離速率更慢^[8]。 隨后越來越多的實驗室和數(shù)據(jù)證明，SARS-CoV-2 S蛋白直接識別并與易感細胞的ACE2 結(jié)合，是病毒感染的關鍵步驟。闡明 SARS-CoV-2 S蛋白及其受體結(jié)合域 ( RBD ) 上的免疫原性特征，就會為有效的疫苗和抗體療法的開發(fā)奠定基礎。

患者的免疫反應特征

紐約大學的Hattori等人開發(fā)了一種不結(jié)合 ACE2 的S-RBD突變體（RBD-T），用于表征94位COVID-19患者血清中的抗 RBD 抗體^[9]。他們使用iQue®高通量流式細胞儀進行了基于細胞和微球的結(jié)合分析。噬菌體展示庫中結(jié)合S蛋白的大多數(shù)克隆 ( 89% )不能結(jié)合RBD（如A4-2）。部分針對RBD的抗體可以識別RBD和RBD-T，對S蛋白的識別較弱 (如B3-4 )。只有 12%的結(jié)合S蛋白和 RBD的抗體可以識別 ACE2 相互作用位點( 如C3-3)。
這說明與 ACE2 相互作用的 RBD 表面的免疫原性低于 S 蛋白和RBD的其他區(qū)域，預示著選擇完整的S蛋白三聚體作為疫苗的免疫原也許更合適。那么進一步分析S 蛋白三聚體的開放或封閉位置的免疫原特性就是必要的。特拉維夫大學的Mor 等人分析了重度和輕度COVID-19患者血液中抗體反應的細胞、分子和功能特征^[10] 。他們使用 Incucyte® S3活細胞分析系統(tǒng)監(jiān)測 SARS-CoV-2 感染誘導的細胞死亡和細胞間融合，以及分離的SARS-CoV-2中和抗體的效果。結(jié)果表明，與恢復期患者相比，重癥新冠肺炎患者表現(xiàn)出高滴度的抗RBD的中和抗體水平以及更高的B細胞擴增能力。 如上圖所示，在活細胞試驗中，紅色熒光信號越弱，代表抗體對病毒的中和抑制作用越強。與對照抗體G053 相比，分離的22個抗體中有6個能有效中和活病毒并防止合胞體的形成。病毒誘導的細胞毒性隨時間延長而增加，加入1，10和100ug/mL的抗體后連續(xù)監(jiān)測60h，TAU-2212 和 TAU-2230等抗體可以顯著地降低細胞的死亡，展示了它們的病毒中和能力。

疫苗的功能和有效性評估

mRNA疫苗作為新型疫苗類型，以其設計簡便，構(gòu)建快速，通用性強、易擴大生產(chǎn)等優(yōu)點備受關注。它很適合用于應對大范圍的新發(fā)傳染病的控制。但是，從體外核酸到體內(nèi)表達出抗原蛋白，如何有效地評價其功能？ 輝瑞&BioNtech的mRNA疫苗（BNT162b2）在其遞交給歐洲藥物管理局（EMA）的評估報告^[11]中提到，利用Octet®分子互作儀（生物層干涉技術(shù)原理）來測定mRNA表達產(chǎn)物的結(jié)合活性。通過生物傳感器分別固化ACE2和抗體，與293T細胞中表達的不同濃度的S蛋白（疫苗表達產(chǎn)物）進行親和力測定。兩者的親和力均在nM級別，符合正常S蛋白與受體及中和抗體的結(jié)合能力，并以此作為疫苗功能確認的指標之一。

除了mRNA疫苗，滅活疫苗是更安全的傳統(tǒng)疫苗，那么目前滅活疫苗打2針，打3針有什么區(qū)別呢？

中科院生物物理所等單位聯(lián)合發(fā)文^[12]，發(fā)現(xiàn)接種第3針滅活疫苗有更好的新冠病毒突變體的廣譜中和活性，可快速引發(fā)B細胞記憶能力和更持久的體液應答，增強免疫反應。他們將構(gòu)建的171株抗體在RBD上的結(jié)合位點進行表位分析，分為I-VI組。通過Octet®親和力檢測發(fā)現(xiàn)，識別IV,V,VI部位的抗體對突變敏感度較低。
并且，打過第3針后的抗體親和力水平總體高于2劑疫苗（3劑苗KD < 1 nM，2劑苗2.31 nM≤ KD≤ 7.75 nM）。3劑苗對突變體的中和能力之所以更強，可能是因為第3針引發(fā)針對IV-VI部位的抗體比率的增加。
重組蛋白疫苗和病毒載體疫苗的本質(zhì)就是抗原蛋白和病毒顆粒。在生產(chǎn)過程中對其不同階段進行濃度分析和監(jiān)測就是必需的工作之一。目前Octet®以其獨特的定量優(yōu)勢，在流感，HPV疫苗等工藝過程控制以及成品的快速質(zhì)控中開始成為高效的工具之一。 將疫苗的抗體固化在傳感器上檢測疫苗濃度，整個實驗在10分鐘內(nèi)完成。線性范圍在0.1~1000ug/mL，覆蓋疫苗生產(chǎn)過程中的濃度范圍，且樣品不需要稀釋^[13]。
Novavax公司的新冠重組蛋白疫苗Nuvaxovid已在歐盟開始使用，也是歐盟批準的第五個新冠疫苗。Novavax公司的新冠重組蛋白疫苗Nuvaxovid已在歐盟開始使用，也是歐盟批準的第五個新冠疫苗。Nuvaxovid（NVX CoV2373）是一種納米顆粒疫苗，由融合前的SARS-CoV-2 S蛋白三聚體和Matrix-M1佐劑組成。根據(jù)III期臨床結(jié)果，在人體內(nèi)可產(chǎn)生極高的抗體滴度。該疫苗的親和力質(zhì)控由Octet®完成，作為質(zhì)量表征屬性的生物學活性指標^[14]。 S1/S2亞基剪切位點682-RRAR-685突變到682-QQAQ-685，以及位于CH的986/987位氨基酸殘基突變成了脯氨酸。突變后解離更慢，親和力明顯增強。
新冠病毒仍然在不斷突變和演化過程中，應對奧密克戎株的新冠疫苗也已經(jīng)開始進入臨床試驗階段。無論是現(xiàn)在還是將來，針對新發(fā)傳染病的病原體研究和相關疫苗及藥物的開發(fā)，仍然是持續(xù)不變的課題。如何在不同步驟和階段進行快速高效的研究，縮短整個開發(fā)周期，這就顯得非常重要。賽多利斯生物分析部門提供的高通量分析設備可以分別在蛋白和細胞水平對多個時間點的小樣本量的眾多變量進行實時監(jiān)測，既保證速度和效率，又可以節(jié)約時間和成本。除了以上案例，對于新型、有效的療法和疫苗的開發(fā)，還具備更廣泛的應用（如下表所示）。 Download

賽多利斯與Wiley雜志聯(lián)合編輯出版《疫苗發(fā)現(xiàn)與開發(fā)：COVID-19的啟示》，匯總了各類疫苗開發(fā)及生產(chǎn)的流程及面臨的關鍵挑戰(zhàn)，以及賽多利斯解決方案如何為疫苗發(fā)現(xiàn)、表征和開發(fā)提供創(chuàng)新的高通量和自動化解決方案。   -參考文獻- 

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12.Kang W, Yunlong C, Yunjiao Z, Jiajing W,et al. A third dose of inactivated vaccine augments the potency, breadth, and duration of anamnestic responses against SARS-CoV-2. MedRxiv 2021.09.02.21261735; doi: https://doi.org/10.1101/2021.09.02.21261735

13.Universal label-free In-process Quantification of Influenza Virus-like particles[J]. Biotechnology Journal, 2017:1700031.

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