PCR擴(kuò)增在幽門螺桿菌耐藥性分析的應(yīng)用

​幽門螺桿菌知多少

幽門螺桿菌是一種螺旋形、微厭氧、對(duì)生長(zhǎng)條件要求十分苛刻的革蘭氏陰性細(xì)菌，1983年首次從慢性活動(dòng)性胃炎患者的胃黏膜活檢組織中分離成功。世界上有約一半的人感染了幽門螺桿菌，但很多沒有臨床癥狀。幽門螺桿菌及其患病率在某些人群中高達(dá)80％。幽門螺桿菌可能通過接觸感染者的唾液、嘔吐物或糞便傳播，食用受污染的食物或水也會(huì)感染。大多數(shù)感染幽門螺桿菌的人都是在兒童時(shí)期感染的。
幽門螺桿菌感染可導(dǎo)致慢性胃炎、消化性潰瘍�。≒UD）、胃癌和胃黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤等胃腸道疾病。它還可能與非消化系統(tǒng)疾病有關(guān)，如口臭、身材矮小、營(yíng)養(yǎng)不良和兒童難治性缺鐵性貧血。根除幽門螺桿菌有助于治療慢性胃炎、PUD 和其他相關(guān)疾病，并降低患胃癌的風(fēng)險(xiǎn)。
  近期，重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院消化科主任李中躍老師課題組在歐洲兒科醫(yī)學(xué)期刊《European Journal of Pediatrics》上發(fā)表Antibiotic resistance of Helicobacter pylori isolated from children in Chongqing, China的研究論文，研究團(tuán)隊(duì)對(duì)重慶地區(qū)兒童幽門螺桿菌耐藥性進(jìn)行了分析。
 
研究背景
幽門螺桿菌 (H. pylori) 感染是人類最常見的慢性細(xì)菌感染之一，作為幽門螺桿菌的一線治療方案，標(biāo)準(zhǔn)的三聯(lián)療法包括一種質(zhì)子泵抑制劑(PPI) 和兩種抗生素：克拉霉素和阿莫西林（如果對(duì)青霉素過敏，可以用甲硝唑代替阿莫西林）。首次引入該療法時(shí)，它達(dá)到了很高的根除率（> 90%）。然而，近年來該方案在世界許多地區(qū)的療效一直在下降，根除率<80%，不再適合臨床實(shí)踐。根除率低的原因可能涉及不適當(dāng)?shù)闹委�、患者依從性差、吸煙、CYP2C19 基因多態(tài)性和胃中的高細(xì)菌負(fù)荷。幽門螺桿菌對(duì)抗生素的耐藥性通常被認(rèn)為是根除失敗的主要原因。突變?cè)谟拈T螺桿菌的抗生素耐藥性中起重要作用。作為最常用的大環(huán)內(nèi)酯類藥物之一，克拉霉素通過可逆地與細(xì)菌23S rRNA分子50S核糖體亞基的結(jié)構(gòu)域V的肽基轉(zhuǎn)移酶環(huán)結(jié)合，抑制蛋白質(zhì)合成。據(jù)報(bào)道，23S rRNA 基因域 V 中的點(diǎn)突變與克拉霉素耐藥性相關(guān)。A2142G 和 A2143G 的點(diǎn)突變（transtions）是最普遍的突變。氟喹諾酮類藥物通過抑制 DNA 促旋酶的活性來干擾細(xì)菌中 DNA 的合成。幽門螺桿菌對(duì)氟喹諾酮類藥物的抗性與 gyrA 基因喹諾酮類藥物抗性決定區(qū)的點(diǎn)突變有關(guān)。

實(shí)驗(yàn)方法
幽門螺桿菌菌株分離：重慶醫(yī)科大學(xué)兒童醫(yī)院消化內(nèi)科門診對(duì)156例疑似幽門螺桿菌感染患兒進(jìn)行胃活檢，在調(diào)查前的最后2個(gè)月內(nèi)，所有兒童均未服用任何H2受體拮抗劑、PPI、鉍和抗生素。通過上消化道內(nèi)鏡在胃竇處采集胃黏膜活檢標(biāo)本，樣本經(jīng)處理培養(yǎng)后，對(duì)疑似透明菌落通過革蘭氏染色和脲酶、過氧化氫酶、氧化酶活性試驗(yàn)鑒定，然后確定幽門螺桿菌。

抗生素藥敏試驗(yàn)：采用瓊脂稀釋法檢測(cè)幽門螺桿菌菌株對(duì)六種抗生素（克拉霉素、甲硝唑、左氧氟沙星、阿莫西林、四環(huán)素和呋喃唑酮）的耐藥性。將幽門螺桿菌懸浮液接種到含有5% 羊血和臨界濃度的單一抗生素的培養(yǎng)板上，然后在微需氧條件下在37°C 下孵育 3 至 5 天�？股�素折點(diǎn)（breakpoints）為克拉霉素≥1.0 μg/mL、甲硝唑≥8.0 μg/mL、左氧氟沙星≥2.0 μg/mL、阿莫西林≥2.0 μg/mL、四環(huán)素≥2.0 μg/mL、呋喃唑酮≥2.0 μg/mL。試驗(yàn)中ACTC11637用作對(duì)照菌株。

23S rRNA 和 gyrA 基因的突變分析：
提取分離菌株的DNA，設(shè)計(jì)引物用于擴(kuò)增23S rRNA 和 gyrA 基因。使用 BIO-GENER PCR 擴(kuò)增儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最后對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，并進(jìn)行 Sanger 測(cè)序以檢測(cè) 23S rRNA 中 2143、2142 位、gyrA 基因中 87 和 91 位密碼子的突變。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。不同性別、年齡組和內(nèi)鏡檢查結(jié)果的耐藥發(fā)生率采用卡方檢驗(yàn)（χ2 檢驗(yàn)），概率（p）值≤0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
其中，基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)中用到的PCR擴(kuò)增儀來自柏恒科技。
 
結(jié)果
研究顯示，共分離出112株（71.8%）幽門螺桿菌。有56名男孩和56名女孩，所有兒童的平均年齡為9.6±3.0歲，范圍為3.0至17.9歲。112例患者中，最常見的癥狀是腹痛（77.7%），內(nèi)鏡下主要表現(xiàn)為幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎（86.6%），僅有15例患者出現(xiàn)十二指腸潰瘍。在 112 個(gè)樣本中，102 個(gè)菌株檢測(cè)到 23S rRNA 和 gyrA 基因的突變。A2143G突變率為48.0%（49/102）；沒有發(fā)現(xiàn)任何 A2142G 突變。gyrA基因突變率為16.7%（17/102），在17株菌株中，對(duì)應(yīng)Asn87和Asp91的突變率分別為9.8%（10/102）和6.9%（7/102）。研究人員還發(fā)現(xiàn)11株同時(shí)具有23S rRNA和gyrA基因突變。沒有觀察到 Asn87 和 Asp91 突變之間的 MIC (最低抑菌濃度)值有顯著差異(p>0.05)。

討論
許多國(guó)家都報(bào)道了兒童對(duì)克拉霉素的耐藥性，其患病率從 16.0% 到 50.9% 不等。在該研究中，克拉霉素的耐藥率為47.3%，高于中國(guó)其他地區(qū)以往報(bào)道（16.4-31.8%），但低于北京（84.9-96.6%）。歐洲的一項(xiàng)多中心研究分析了門診社區(qū)中抗生素使用與抗生素耐藥性之間的關(guān)系，以治療幽門螺桿菌感染，并表明長(zhǎng)效大環(huán)內(nèi)酯類藥物的使用與幽門螺桿菌對(duì)克拉霉素的耐藥性相關(guān)。在大環(huán)內(nèi)酯類中也觀察到強(qiáng)烈的交叉耐藥性。因此，中國(guó)幽門螺桿菌感染兒童對(duì)克拉霉素的高耐藥性可能歸因于大環(huán)內(nèi)酯類藥物在呼吸系統(tǒng)和其他疾病中的頻繁使用。 在臨床實(shí)踐中調(diào)節(jié)和限制大環(huán)內(nèi)酯類的給藥可能有利于降低高耐藥性。

重慶市幽門螺旋桿菌感染兒童對(duì)克拉霉素、甲硝唑和左氧氟沙星耐藥率較高。大多數(shù)克拉霉素耐藥菌株均檢測(cè)到A2143G突變，而gyrA突變點(diǎn)的Asn87和Asp91在左氧氟沙星耐藥菌株中常見。在臨床實(shí)踐中，抗幽門螺桿菌治療應(yīng)根據(jù)藥敏試驗(yàn)個(gè)體化。
 
在今天的介紹中，我們了解了關(guān)于幽門螺桿菌耐藥一些情況及背后分子層面機(jī)理，對(duì)于我們預(yù)防和治療幽門螺桿菌提供了不少信息。分子層面研究可以用到的PCR儀簡(jiǎn)介如下，歡迎咨詢了解更多。
 
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