利用流式細(xì)胞術(shù)和活細(xì)胞分析對CAR-T細(xì)胞進(jìn)行表型和功能表征

過去幾年中，成功使用免疫療法幫助抗擊癌癥的范圍迅速擴(kuò)大，許多療法現(xiàn)已獲批用于臨床。其中嵌合抗原受體（CAR）T細(xì)胞的引入在該領(lǐng)域處于領(lǐng)先地位。CAR構(gòu)建體旨在與腫瘤細(xì)胞上存在的特異性表面表位或抗原相互作用，一旦接近就能使T細(xì)胞殺死腫瘤細(xì)胞，同時不傷害健康細(xì)胞。當(dāng)腫瘤細(xì)胞上的特定抗原可被識別時，CAR-T細(xì)胞就會顯示出靶向作用，并且由于其來自于患者自身（稱為自體療法），因此沒有排斥反應(yīng)。

CD19靶向CAR-T細(xì)胞療法，例如Kymriah®（Novarits）或Yescarta®（Kite/Gilead），已經(jīng)在淋巴細(xì)胞白血病和非霍奇金淋巴瘤等常見的液體腫瘤治療中取得臨床成功。如圖1所示，自體CAR-T材料的開發(fā)和擴(kuò)增涉及多個階段。在所有階段，均需要對所產(chǎn)生的產(chǎn)品進(jìn)行質(zhì)量和功能評估，同時最大程度地縮短從最初捐贈到重新引入患者體內(nèi)的時間。
 
iQue® 高通量流式細(xì)胞儀作為一種高通量、多參數(shù)、低成本的細(xì)胞定量分析工具，為進(jìn)一步提升CAR-T細(xì)胞的構(gòu)建效率以及治療反應(yīng)等提供解決方案。
 
接下來，我們通過兩個案例分享一下iQue® 3高通量流式細(xì)胞儀是如何助力CAR-T細(xì)胞表征的吧！

應(yīng)用                                                      CD19-靶向CAR-T細(xì)胞的
案例1                                                           特異性殺傷特征

CAR-T細(xì)胞具備特異性殺傷功能。為了在體外證明這種特異性，首先將抗CD19 CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞或供體匹配的模擬轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞用于Incucyte® 免疫細(xì)胞殺傷試驗。在收集圖像的同時，分別于第2天、第4天和第7天取樣，在iQue® 高通量流式細(xì)胞儀上利用iQue® 人類T細(xì)胞活化試劑盒和iQue®人類T細(xì)胞殺傷試劑盒評估了表型和功能，并通過iQue® 人類T細(xì)胞配套試劑盒量化細(xì)胞因子IL-2。這些試劑盒能對T細(xì)胞表面標(biāo)志物和指示T細(xì)胞活化和腫瘤細(xì)胞殺傷的分泌蛋白進(jìn)行量化。結(jié)果顯示，當(dāng)與抗原陽性的Ramos細(xì)胞結(jié)合時，CD8+細(xì)胞上的T細(xì)胞活化標(biāo)志物CD69、CD25和PD-1（分別為圖2A-C）迅速上調(diào)。該上調(diào)表現(xiàn)出一定的時間依賴性，在第7天觀察到的水平最高，但CAR-T細(xì)胞密度之間幾乎沒有差異。在與抗原陰性的Jurkat細(xì)胞共培養(yǎng)或在有模擬轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞存在的情況下，所有3種活化標(biāo)志物的表達(dá)均很低（<7%）。存在Ramos細(xì)胞的情況下，分泌的細(xì)胞因子IFNγ和IL-2（活化指標(biāo)）的濃度在早期時間點增加，但到第7天有所下降，表明是瞬態(tài)響應(yīng)。在含有CAR-T細(xì)胞的共培養(yǎng)物中，細(xì)胞殺傷力的指標(biāo)——顆粒酶B的釋放增加，但僅在抗原陽性的Ramos細(xì)胞存在時發(fā)生。對于所有分泌蛋白，隨著CAR-T密度的增加，水平普遍有所增加。總的來說，這種完整的量化分析結(jié)果顯示了抗CD19 CAR-T細(xì)胞明確的抗原特異性活化，這是由表面標(biāo)志物和分泌蛋白與殺死表達(dá)抗原的腫瘤細(xì)胞的功能指標(biāo)共同判定的。
 
應(yīng)用                                                                抗原激發(fā)下
案例2                                                     CAR-T細(xì)胞的耗竭表征

重復(fù)暴露于腫瘤細(xì)胞抗原可導(dǎo)致CAR-T細(xì)胞耗竭。研究耗竭的CAR-T細(xì)胞的表型有助于提高我們對這種耗竭如何影響臨床響應(yīng)的持續(xù)時間的理解。為了在體外研究這個問題，通過不斷用抗原陽性的Ramos細(xì)胞系激發(fā)抗CD19的CAR-T細(xì)胞誘導(dǎo)CAR-T細(xì)胞耗竭。每隔2-3天，持續(xù)10天，對CAR-T細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，并用新鮮的Ramos細(xì)胞（1:1 T:E）重新刺激。第11天，對刺激的CAR-T細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，并與Ramos細(xì)胞（1:1 T:E）接種到96孔板上。在與Ramos共培養(yǎng)和作為單一培養(yǎng)的情況下，接種一個新鮮批次的未耗竭CAR-T細(xì)胞進(jìn)行比較。每天從檢測板的所有孔中提取細(xì)胞因子樣品（10 μL），72小時后，使用iQue®人類T細(xì)胞耗竭試劑盒對細(xì)胞和上清液進(jìn)行量化。結(jié)果如圖3所示。
 
細(xì)胞因子的分泌，包括IFNγ和TNFα，在含有耗竭的CAR-T和Ramos細(xì)胞共培養(yǎng)的孔中均很低（圖3A和B）。相對而言，新鮮CAR-T細(xì)胞分泌的IFNγ和TNFα水平明顯較高，48小時的峰值濃度分別為3.5±0.2 ng/mL和0.6±0.1 ng/mL。新鮮的CAR-T細(xì)胞在單一培養(yǎng)中產(chǎn)生的每種細(xì)胞因子的水平都很低。在有重復(fù)抗原激發(fā)的T細(xì)胞的孔中，這種細(xì)胞因子分泌的明顯損失是其枯竭的一個明顯標(biāo)志。72小時后，LAG-3衰竭標(biāo)志物的表達(dá)在激發(fā)的CAR-T細(xì)胞中高度升高，86±0.3%的CD4+細(xì)胞群對這種表型呈陽性，而新鮮刺激的CD4+CAR-T細(xì)胞僅有31±0.6%的表達(dá)（圖3C）。CAR-T細(xì)胞單一培養(yǎng)有一小部分細(xì)胞群對LAG-3呈陽性（17±0.8%）。在共培養(yǎng)孵育中，也觀察到耗竭CAR-T細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞的能力有所下降（圖3D）。非耗竭的CAR-T細(xì)胞能夠比耗竭的CAR-T細(xì)胞更有效地減少Ramos細(xì)胞數(shù)量，從含有非耗竭的CAR-T細(xì)胞的孔中，iQue® 獲得的數(shù)值平均為每sip 4606±463個細(xì)胞，而耗竭的CAR-T細(xì)胞為每sip 8483±688個細(xì)胞。T細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞的能力下降是耗竭的另一個標(biāo)志。綜上，這種完整的量化結(jié)果顯示了這些抗-CD19的CAR-T細(xì)胞有明顯的抗原特異性驅(qū)動的耗竭特征。

Summary

眼明心亮的同學(xué)不難從兩個案例看出，iQue® 高通量流式細(xì)胞儀不僅可以在極低的樣品消耗量下準(zhǔn)確定量檢測相應(yīng)的生物學(xué)指標(biāo)，同時提供完善的配套試劑。例如，上述兩個案例中提到的iQue®人類T細(xì)胞活化試劑盒、iQue®人類T細(xì)胞殺傷試劑盒、iQue®人類T細(xì)胞配套試劑盒量化細(xì)胞因子IL-2以及iQue®人類T細(xì)胞耗竭試劑盒（圖4）。為大家提供了更優(yōu)的工作效率和樣品前處理體驗。
 
細(xì)胞療法的使用正在迅速發(fā)展，人們越來越關(guān)注提高用于臨床的細(xì)胞生產(chǎn)效率。使用先進(jìn)生物分析技術(shù)能夠助力改善構(gòu)建體的壽命、選擇性，優(yōu)化生產(chǎn)工藝以及安全性。iQue® 3高通量流式細(xì)胞儀為新一代CAR-T開發(fā)提供智能的解決方案。

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下載白皮書《使用先進(jìn)的流式細(xì)胞術(shù)和活細(xì)胞分析進(jìn)行CAR-T 細(xì)胞表型和功能表征》