超連續(xù)譜激光器在光片熒光顯微鏡中的應(yīng)用

光片熒光顯微鏡的優(yōu)點(diǎn)

光片熒光顯微鏡（LSFM）是一種可以對(duì)活體標(biāo)本進(jìn)行快速且無光毒性3D觀測(cè)的強(qiáng)大顯微成像技術(shù)。LSFM技術(shù)將寬場(chǎng)成像的速度與適度的光學(xué)切片和低光漂白特點(diǎn)相結(jié)合，因此也被稱為選擇性平面照明顯微鏡（SPIM），或簡(jiǎn)稱為“光片”。SPIM或LSFM共同的定義特征是從側(cè)面對(duì)焦平面進(jìn)行平面照明，在任何給定時(shí)間，僅對(duì)樣品的一小部分進(jìn)行照明，因此與寬場(chǎng)輻射熒光相比，可以最大限度地減少光損傷并提供改善信噪比的光學(xué)切片。此外由于圖像是以寬場(chǎng)（2D平行）方式收集的，因此光片成像比一次僅檢測(cè)一個(gè)像素的點(diǎn)掃描共聚焦顯微鏡快得多。
 

由于三個(gè)關(guān)鍵特性，光片熒光顯微鏡正成為體積成像最流行的技術(shù)之一：

1.激發(fā)點(diǎn)被限制在焦平面附近，光損傷被最小化，生物可以存活更長(zhǎng)的時(shí)間；

2.容易獲得良好的光學(xué)切片，通常接近共聚焦顯微鏡；

3.采集速度非�？�，比傳統(tǒng)的共聚焦顯微鏡快幾個(gè)數(shù)量級(jí)。
 

從本質(zhì)上講，光片顯微鏡通�；�于熒光技術(shù)，一般來說，研究中的樣品需要正確標(biāo)記才能成像。使用彈性散射光可以生成未標(biāo)記樣本的圖像，但目前主要的障礙是這些圖像通常受到散斑的影響。為了解決這個(gè)不便，Pablo Loza-Alvarez, Omar Alarte, David Merino of ICFO-Institut de Ciencies Fotoniques with Diego Battista and Giannis Zacharakis of Foundation for Research and Technology-Hellas使用來自樣本的彈性散射光來生成圖像，以避免對(duì)樣品的標(biāo)記。他們使用了低時(shí)間相干的超連續(xù)譜激光光源作為一種候選光源，以減少散射光在光片顯微鏡圖像中固有的散斑。
 

在這項(xiàng)工作中，他們提出了一種基于光片的新型光學(xué)裝置，該裝置采用了三種方法來處理彈性散射圖像帶來的散斑，分別是偏振濾波、降低激發(fā)光源的時(shí)間相干性和降低光片的空間相干性，這些策略可以在不依賴熒光標(biāo)記的前提下使具有挑戰(zhàn)性的生物樣品結(jié)構(gòu)特征的原始光片彈性散射成像成為可能。
 

光片顯微鏡中的偏振和相干控制

在該實(shí)驗(yàn)中，彈性散射光片顯微鏡的主要部件是來自西班牙FYLA公司的超連續(xù)譜光纖激光器，它發(fā)出從可見光到紅外光的寬帶光譜。該光源具有非常寬的光譜帶寬，同時(shí)，它呈現(xiàn)出非常低的時(shí)間相干性，這對(duì)于減少圖像中的散斑效應(yīng)都是非常重要的。對(duì)FYLA白色激光選擇500至700nm（140nm FWHM）的波段用于光片熒光顯微鏡，可以提供較低的時(shí)間相干性以降低散斑對(duì)比度。

圖1：彈性散射光片顯微鏡中偏振和相干控制的實(shí)驗(yàn)裝置示意圖。圖（a）：光片照明光路由一對(duì)發(fā)射波長(zhǎng)分別為515nm和638nm的二極管激光器和一個(gè)超連續(xù)譜激光器（SCL）組成。激光束在進(jìn)入顯微鏡之前被放大10倍。P1是一個(gè)半波片（HWP），它在通過柱面透鏡（CL）、振鏡（GM）和照明物鏡（OBJill）之前控制三束光束的偏振。GM掃描OBJill瞳孔處的光束，在樣品平面上產(chǎn)生一個(gè)旋轉(zhuǎn)的光片。樣品保存在裝滿水的定制浸沒室（C）中。檢測(cè)系統(tǒng)由一個(gè)0.5N.A.物鏡（OBJdet）、一個(gè)200mm管透鏡（總放大倍率為20X）和一個(gè)偏振器（P2）組成。圖（b）：FYLA激光器在500-700nm（140nmFWHM）波段的發(fā)射光譜，紅色垂直波段為紅色二極管激光器的帶寬（1.2nm）。圖（c）：靠近照明物鏡（OBJill）的光學(xué)設(shè)置的細(xì)節(jié)，說明了旋轉(zhuǎn)光片方法。FYLA激光片圍繞位于OBJill工作距離（WD）的軸旋轉(zhuǎn)，即位于樣品平面的中心

FYLA超連續(xù)譜激光是否在LSFM中實(shí)現(xiàn)了無標(biāo)記的結(jié)構(gòu)成像?

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與其他光譜帶寬較窄的光源相比，Iceblink超連續(xù)譜光源對(duì)LSM圖像的散斑貢獻(xiàn)較低，從而可以總結(jié)出彈性散射光片顯微鏡是一種適用于無標(biāo)記結(jié)構(gòu)成像的新型光片成像方式。為了提高此配置中的成像質(zhì)量，他們還建議實(shí)施：1、偏振控制，可實(shí)現(xiàn)對(duì)比度選擇性并消除基板背景。2、時(shí)間和空間相干性降低，可以從散斑噪聲中提取內(nèi)源性內(nèi)在對(duì)比度。
 

以這種方式實(shí)施，彈性散射光片成像為標(biāo)準(zhǔn)LSFM實(shí)驗(yàn)提供了有用的補(bǔ)充結(jié)構(gòu)信息，如MCTS樣品所示。此外，它有可能類似于組織切片但以非破壞性方式提供樣品的相關(guān)形態(tài)學(xué)細(xì)節(jié)。最后，彈性散射光片顯微鏡是一種很有前途的技術(shù)，可以進(jìn)行新的有趣的實(shí)驗(yàn)，例如，在受低信噪比限制的應(yīng)用中替代LSFM，例如功能成像或快速體積結(jié)構(gòu)成像。

圖2：使用彈性散射光片顯微鏡系統(tǒng)獲得的線蟲頭部圖像。a）使用FYLA光源的蠕蟲頭部3D圖像堆棧的最大強(qiáng)度投影（圖像尺寸為230×110μm）。b）是使用FYLA Iceblink光源獲得的（a）平面之一的細(xì)節(jié)（圖像為80×40μm）。c）是使用488nmCW二極管激光器獲得的與（b）相同的圖像（圖像為80×40μm）

來源文獻(xiàn)：

Enhanced Light Sheet Elastic Scattering Microscopy by Using a Supercontinuum Laser.

Diego Di Battista, David Merino, Giannis Zacharakis, Pablo Loza-Alvarez and Omar E. Olarte.

關(guān)于超連續(xù)激光器

超連續(xù)譜激光器（Supercontinuum Sources）又稱白光激光器。2000年，RANKA等報(bào)道了在光子晶體光纖中產(chǎn)生2倍頻程的超連續(xù)譜，超連續(xù)譜的產(chǎn)生為非線性光纖光學(xué)領(lǐng)域的研究注入了新的活力。利用光子晶體光纖產(chǎn)生超連續(xù)譜是一種新型的光源，它具有高的輸出功率、平坦的寬帶光譜、高度的空間相干性（聚焦）等特性，能極大提高信噪比、減小測(cè)量時(shí)問以及加寬光譜測(cè)量范圍。光纖超連續(xù)譜光源可應(yīng)用在光纖衰減測(cè)量、干涉測(cè)量?jī)x、光相十?dāng)z影術(shù)、光譜學(xué)分析、生物成像、光學(xué)頻率梳等領(lǐng)域。
 

關(guān)于Iceblink超連續(xù)激光器

Iceblink是一款覆蓋450- 2300nm光譜范圍的超連續(xù)光纖激光器，具有超過1W的平均功率和卓越的穩(wěn)定性(0.5%標(biāo)準(zhǔn)偏差)。它是一種用途廣泛的白光光源，在科學(xué)和工業(yè)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，典型應(yīng)用包括材料表征、VIS、NIR和IR光譜、單分子光譜和熒光激發(fā)的吸收/透射測(cè)量。 Iceblink的空間相干性和寬光譜范圍使其成為傳統(tǒng)燈源、單波長(zhǎng)激光器、LED和ASE光源的絕 佳替代品。

圖3：Iceblink超連續(xù)激光器實(shí)物圖

規(guī)格指標(biāo)：

圖4：Iceblink超連續(xù)激光器典型光譜

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