甲氨蝶呤在擾動(dòng)流下通過抑制 YAP/TAZ 對動(dòng)脈粥樣硬化的保護(hù)作用

動(dòng)脈粥樣硬化目前是全世界死亡的主要原因。動(dòng)脈粥樣硬化病變在血流紊亂（DF）部位的動(dòng)脈中發(fā)展，剪切應(yīng)力在斑塊位置和進(jìn)展中起關(guān)鍵作用。研究表明，抑制 Hippo 通路效應(yīng)因子Yes-相關(guān)蛋白（YAP）和具有 PDZ 結(jié)合基序（TAZ）的轉(zhuǎn)錄共激活因子可減輕 DF 誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化病變的發(fā)展。YAP/TAZ 響應(yīng)血流動(dòng)力學(xué)并將機(jī)械信號轉(zhuǎn)換為化學(xué)信號。DF促進(jìn)YAP/TAZ活化和去磷酸化，去磷酸化形式的YAP從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，上調(diào)富含半胱氨酸的血管生成誘導(dǎo)因子61（CYR61）和結(jié)締組織生長因子（CTGF ）等靶基因，并刺激促炎基因表達(dá)，從而增加單核細(xì)胞的附著和浸潤，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。
 

幾項(xiàng)研究表明，長期低劑量甲氨蝶呤（MTX）治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎與降低心血管疾病和心血管死亡率有關(guān)。MTX 增加一磷酸腺苷（AMP）和5-氨基咪唑-4-羧基酰胺核糖核苷酸（AICAR）的細(xì)胞內(nèi)積累，從而激活 AMP 活化蛋白激酶（AMPK）。AMPK 在促進(jìn) YAP Ser127 位點(diǎn)磷酸化中發(fā)揮作用，使 YAP 磷酸化以誘導(dǎo)其細(xì)胞質(zhì)定位和蛋白酶體降解，因此，AMPK 的激活導(dǎo)致 YAP 磷酸化和失活。
 

基于此，在哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院心內(nèi)科、心外科以及附屬心肌缺血教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的一項(xiàng)研究中，假設(shè) AMPK 通路介導(dǎo) YAP/TAZ 功能失活和 MTX 的動(dòng)脈粥樣硬化保護(hù)作用，實(shí)驗(yàn)評估了 MTX 對動(dòng)脈粥樣硬化保護(hù)作用的貢獻(xiàn)以及對 DF 保護(hù)作用的背后信號機(jī)制。文章名為《Atheroprotective effects of methotrexate via the inhibition of YAP/TAZ under disturbed flow》。

 

HUVECs中YAP/TAZ激活和核定位的血流動(dòng)力學(xué)調(diào)節(jié)
 

為了研究 YAP/TAZ 在不同剪切力下 HUVECs 中的作用，將培養(yǎng)的 HUVECs 暴露于單向剪切應(yīng)力（USS）12 dyn/cm2、擾流（DF） 0 ± 4 dyn/cm2 或靜態(tài)條件（STA）下 10 小時(shí)。通過蛋白質(zhì)印跡測量了 p-YAP（Ser127）、總 YAP/TAZ 和粘附分子的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。結(jié)果表明，DF 導(dǎo)致 p-YAP（Ser127）顯著降低和 ICAM1、VCAM1 和 TAZ 表達(dá)顯著增加。IF 染色顯示 DF 導(dǎo)致 YAP/TAZ 核定位，而在接受 USS 的 HUVECs 中觀察到增加的 YAP/TAZ 細(xì)胞質(zhì)保留。此外，還通過 IF 檢測了 YAP 磷酸化水平，發(fā)現(xiàn)DF顯著降低p-YAP。

DF促進(jìn)了YAP/TAZ的轉(zhuǎn)錄活性并顯著增加了YAP/TAZ靶基因CYR61和CTGF的表達(dá)。相反，USS 增強(qiáng)了 p-YAP并降低了 YAP/TAZ 靶基因表達(dá)。此外，生物力學(xué)拉伸介導(dǎo) HUVECs 募集單核細(xì)胞的能力。使用細(xì)胞粘附測定，發(fā)現(xiàn)在 DF 下附著在 HUVECs 上的 THP1 單核細(xì)胞數(shù)量增加，這伴隨著粘附分子的上調(diào)。
這些結(jié)果表明，DF 導(dǎo)致 YAP 去磷酸化和激活，而 USS 導(dǎo)致 YAP 磷酸化和失活。
 

MTX 磷酸化 AMPK 并減輕 DF 誘導(dǎo)的 HUVECs 中促炎細(xì)胞因子的表達(dá)
 

用 MTX（0-100 nM）處理 HUVECs，48 小時(shí)后通過蛋白質(zhì)印跡定量 p-AMPK 水平。結(jié)果表明，在靜態(tài)條件下培養(yǎng)的 HUVECs 中的 p-AMPK 以劑量依賴性方式增加，最大水平為 100 nM時(shí)。該濃度與患者血漿的常規(guī)治療低劑量劑量一致。

為了確定 MTX 是否在血流動(dòng)力學(xué)作用下改變促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，使用 qRT-PCR 分析促炎細(xì)胞因子基因和 YAP/TAZ 靶基因的水平。在 DF 下觀察到更高水平的IL-6、IL-8、CYR61和CTGF，而不是在 HUVECs 中的 USS，并且 MTX 處理顯著抑制了它們的表達(dá)。

為了確定低劑量 MTX 是否誘導(dǎo) AMPK 下游的變化，檢測了不同流動(dòng)條件下 p-YAP（Ser127）的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。結(jié)果表明，DF而非USS導(dǎo)致YAP磷酸化顯著降低。然而，當(dāng)在 USS 下比較 MTX 處理與對照效果時(shí)，沒有觀察到 YAP 磷酸化的顯著變化。MTX處理導(dǎo)致DF或STA下p-YAP表達(dá)顯著增加，后者導(dǎo)致MTX處理后p-YAP表達(dá)更高。

 

MTX 抑制 DF 誘導(dǎo)的 YAP/TAZ 活化并發(fā)揮動(dòng)脈粥樣硬化保護(hù)作用，而沉默 AMPKα 可逆轉(zhuǎn)這些作用
 

接下來探討了 MTX 是否在生物力學(xué)拉伸下介導(dǎo) HUVECs 中的 YAP/TAZ 失活。蛋白質(zhì)印跡分析顯示，DF 下 MTX 顯著上調(diào) p-YAP 和 p-AMPK 的表達(dá)，并顯著降低 ICAM1 和 VCAM1 的水平。還觀察到總 YAP 在細(xì)胞質(zhì)中以高水平組成性表達(dá)，并且在 DF 下 MTX（100 nM）處理后單核細(xì)胞粘附減少。這些數(shù)據(jù)表明 MTX 介導(dǎo) YAP 抑制并減少單核細(xì)胞-HUVEC 相互作用，至少部分有助于抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。

因?yàn)?nbsp;YAP 可以被 AMPK 磷酸化，于是進(jìn)一步探討了 AMPK 在這種 MTX 誘導(dǎo)的保護(hù)作用中的作用，并確定 MTX 介導(dǎo)的 YAP 磷酸化是否依賴于 AMPK。siRNA 耗盡 AMPKα促進(jìn)了 YAP 核轉(zhuǎn)位，幾乎消除了 MTX 介導(dǎo)的 YAP 磷酸化和 p-YAP 細(xì)胞質(zhì)定位，表明 AMPK 在介導(dǎo) MTX 誘導(dǎo)的YAP 失活中的關(guān)鍵作用。在 HUVECs 中敲低 AMPK 后，DF 下單核細(xì)胞粘附蛋白的水平和單核細(xì)胞粘附均顯著增加。
 

沉默 YAP 會(huì)降低 DF 下的粘附分子表達(dá)
 

為了進(jìn)一步證實(shí) YAP 和 DF 誘導(dǎo)的促炎反應(yīng)之間的關(guān)聯(lián)，針對 YAP 的 siRNA 被用來檢查 YAP、粘附分子和 AMPK 之間的相互作用。蛋白質(zhì)印跡結(jié)果表明，敲除 YAP 顯著抑制 ICAM1 和 VCAM1 的表達(dá)，但不改變 DF 下的 p-AMPK 蛋白水平，表明 AMPK 作用于 YAP 上游，并且 YAP 耗竭可能導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化。
 

MTX對DF誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和YAP磷酸化的影響
 

受損的內(nèi)皮功能包括動(dòng)脈粥樣硬化的早期階段。實(shí)驗(yàn)采用流式細(xì)胞儀檢測 DF 下的細(xì)胞凋亡。與 STA 相比，DF 而不是 USS 的應(yīng)用顯著增加了總細(xì)胞凋亡率。然而，用 MTX 治療并沒有減少細(xì)胞凋亡。

使用蛋白質(zhì)印跡分析，檢測到在 DF 下用 MTX 和廣泛使用的動(dòng)脈粥樣硬化藥物阿托伐他汀處理的 HUVECs 中 p-YAP 表達(dá)水平相當(dāng)。結(jié)果表明，在 MTX（100 nM）或阿托伐他�。�1 μM）存在下細(xì)胞暴露于 DF 會(huì)導(dǎo)致 YAP 過度磷酸化。MTX和他汀類藥物治療之間的p-YAP表達(dá)水平?jīng)]有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異。
 

MTX 治療可減少體內(nèi) DF 誘導(dǎo)的斑塊形成
 

為了確定低劑量 MTX 在體內(nèi)的潛在抗動(dòng)脈硬化作用，在左頸總動(dòng)脈周圍放置了一個(gè)鑄型以誘導(dǎo) DF。在暴露于西式飲食 4 周后，在 DF 區(qū)域出現(xiàn)了明顯的動(dòng)脈粥樣硬化病變。YAP/TAZ 染色在動(dòng)脈粥樣硬化切片的內(nèi)膜、中層和內(nèi)膜增生斑塊中顯著。相反，用MTX治療小鼠導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化斑塊和YAP/TAZ的相對表達(dá)顯著減少。此外，DF 區(qū)域的管腔大于 0.9% 鹽水處理的管腔。
 

總之，得出結(jié)論，MTX 通過 AMP 依賴性激酶（AMPK）-YAP/TAZ 通路發(fā)揮保護(hù)作用。從治療的角度來看，這些發(fā)現(xiàn)提供了對 MTX 賦予動(dòng)脈粥樣硬化保護(hù)機(jī)制的見解，并可能有助于開發(fā)新的治療方法來限制動(dòng)脈粥樣硬化。
 

參考文獻(xiàn)：Liu D, Lv H, Liu Q, Sun Y, Hou S, Zhang L, Yang M, Han B, Wang G, Wang X, Du W, Nie H, Zhang R, Huang X, Hou J, Yu B. Atheroprotective effects of methotrexate via the inhibition of YAP/TAZ under disturbed flow. J Transl Med. 2019 Nov 15;17(1):378. doi: 10.1186/s12967-019-02135-8. PMID: 31730006; PMCID: PMC6857284.

文章來源：http://www.naturethink.com/?news/237.html

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