剪切和動態(tài)壓縮在體外調(diào)節(jié)人單核細(xì)胞的炎癥表型

單核細(xì)胞和單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞是關(guān)鍵的免疫效應(yīng)細(xì)胞，在宿主防御中起著至關(guān)重要的作用，并有助于組織重塑和修復(fù)。巨噬細(xì)胞具有高度的可塑性，具有響應(yīng)環(huán)境線索改變表型的潛力，并且可以根據(jù)促炎（M1）或抗炎（M2）亞群進(jìn)行分類。浸潤的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞可能會影響肌肉骨骼組織修復(fù)過程的成功。
 

單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞存在于重塑組織的部位，這些組織受到機(jī)械力的影響，并且與修復(fù)反應(yīng)有關(guān)。隨著骨免疫學(xué)領(lǐng)域越來越重要，需要更詳細(xì)地研究機(jī)械刺激對免疫細(xì)胞表型的影響。然而，巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞（它們的譜系前體）對骨骼組織固有的機(jī)械力的反應(yīng)以及這種機(jī)械刺激對巨噬細(xì)胞表型的影響需要進(jìn)一步闡明。
 

因此，瑞士AO達(dá)沃斯研究所一項研究的目的是研究機(jī)械剪切和壓縮負(fù)荷對單核細(xì)胞活化和表型的影響。未刺激的、M1 或 M2 刺激的原代人單核細(xì)胞以及人單核細(xì)胞報告細(xì)胞系 THP1-Blue在體外暴露于剪切和壓縮負(fù)荷的組合中，在機(jī)械刺激 3 天后評估炎癥介質(zhì)的基因表達(dá)水平和炎癥蛋白分泌。文章名為《Shear and Dynamic Compression Modulates the Inflammatory Phenotype of Human Monocytes in vitro》。
 

為了研究機(jī)械負(fù)荷對巨噬細(xì)胞表型的影響，在負(fù)載前72小時，用 10 ng/ml IFN-γ （干擾素-γ，人單核THP1細(xì)胞的重要激活因子）和 100 ng/ml LPS（脂多糖）刺激CD14+ 單核細(xì)胞，誘導(dǎo)其分化為促炎/M1 表型，10 ng/ml IL-4 誘導(dǎo)其分化為抗炎/M2 表型或未刺激。在加載前 24 小時制備含有 THP1-Blue 單核細(xì)胞的瓊脂糖凝膠。剪切（1 Hz，±25° ball rotation）和壓縮（10%，1 Hz 壓縮應(yīng)變）每天1小時，連續(xù)3天。

多軸加載后差異激活的原代人單核細(xì)胞的促炎基因和蛋白質(zhì)表達(dá)

與 IL-4 （白細(xì)胞介素-4）刺激的單核細(xì)胞相比，LPS和 IFN-γ 刺激的單核細(xì)胞在自由膨脹條件下具有顯著更高的促炎基因IL8和CCL2的基因表達(dá)水平（分別增加 10.3 倍和 28.3 倍），證實了其促炎癥表型（圖1 A）。此外，與 LPS 和 IFN-γ 刺激的單核細(xì)胞相比，IL-4 刺激的單核細(xì)胞與顯著更高的CCL18表達(dá)相關(guān)（增加 41.5 倍），證實了它們向 M2 樣表型的極化。

與在自由膨脹條件下培養(yǎng)的單核細(xì)胞相比，在機(jī)械負(fù)荷 3 天后，未受刺激的原代人單核細(xì)胞顯著上調(diào)促炎基因IL6（5.9 倍變化）和IL8（2.8 倍變化）的基因表達(dá)水平（圖1 B）。此外，與自由膨脹對照相比，所有四名供體的抗炎巨噬細(xì)胞標(biāo)志物IL10的表達(dá)均降低，負(fù)載后供體 1 和 3 中檢測不到基因表達(dá)水平。炎癥介質(zhì)CCL18、TNF和CCL2的表達(dá)水平無顯著差異。

雖然在機(jī)械負(fù)荷后觀察到 LPS 和 IFN-γ 激活的單核細(xì)胞對炎癥基因表達(dá)的相似趨勢，但在供體之間觀察到更大的變化，這些發(fā)現(xiàn)沒有統(tǒng)計學(xué)意義（圖1 C）。然而，CCL2的表達(dá)顯著降低（降低 1.9 倍）。此外，在負(fù)載后，來自供體 1 和 3 的 LPS 和 IFN-γ 刺激的單核細(xì)胞中也檢測不到 IL10的基因表達(dá)水平。與未刺激的單核細(xì)胞類似，IL-4 激活的細(xì)胞也顯著增加了IL6（8.9 倍變化）并降低了IL10（3.1 倍）的表達(dá)（圖1 D）。

圖1   多軸加載后差異激活的原代人單核細(xì)胞的炎癥基因表達(dá)。

（A）由實時 PCR 測量的在自由膨脹條件下培養(yǎng) 6 天的原代單核細(xì)胞的基因表達(dá)。
（B）多軸負(fù)載 3 天后，未受刺激的原代人單核細(xì)胞或 LPS 和 IFN-γ（C）或 IL-4（D）刺激的單核細(xì)胞基因表達(dá)水平。

與自由膨脹對照相比，未受刺激的單核細(xì)胞的機(jī)械負(fù)荷顯著增加了促炎介質(zhì) TNF-α（17.1 ± 8.9 vs 8 ± 7.4 pg/ml）和 MIP-1α（636.8 ± 471.1 vs 124.1 ± 40.1 pg/ml）以及 IL-13（42.1 ± 19.8 vs 21.7 ± 13.6）的產(chǎn)生（圖2）。

由負(fù)載的未刺激單核細(xì)胞產(chǎn)生的 IL-10、CCL18、IP-10、MCP-1、MDC 和 IL-1β 的蛋白質(zhì)水平與自由膨脹對照組沒有顯著差異。與基因表達(dá)水平相似，響應(yīng)于未刺激的單核細(xì)胞的負(fù)載，IL-6 產(chǎn)生增加的趨勢。然而，觀察到較大的供體變異，這一發(fā)現(xiàn)在靜態(tài)上并不顯著。除了 TNF-α、MIP-1α 和 IL-13 之外，機(jī)械刺激顯著增加了LPS 和 IFN-γ 刺激的單核細(xì)胞的 MDC 水平（圖2）。與基因表達(dá)數(shù)據(jù)相似，IL-4 激活的單核細(xì)胞響應(yīng)機(jī)械負(fù)荷 顯著增加促炎因子 IL-6、IL-8、TNF-α、MIP-1α、IP-10、IL-13、IL -1β 和 IL-10的表達(dá)，并降低 CCL18 和 MDC 的表達(dá)（圖2）。 

圖2   多軸加載后原代人單核細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥介質(zhì)，通過 ELISA 和多重測定進(jìn)行量化。

IL-6：白細(xì)胞介素-6；IL-10：白細(xì)胞介素-10；CCL18：趨化因子（CC 基序）配體18；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；MIP-1α：巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-1α；IP-10：CXC 基序趨化因子 10；MCP-1：單核細(xì)胞趨化蛋白-1；IL-13：白細(xì)胞介素-13；MDC：巨噬細(xì)胞衍生趨化因子；IL-1β：白細(xì)胞介素-1β；IL-8：白細(xì)胞介素-8。
 

THP1-Blue 單核細(xì)胞在機(jī)械剪切力或壓縮力后的炎癥基因和蛋白質(zhì)表達(dá)

為了評估機(jī)械剪切力或壓縮力對人類單核細(xì)胞炎癥基因和蛋白質(zhì)表達(dá)的差異調(diào)節(jié)的潛力，將未受刺激的 THP1-Blue 單核細(xì)胞置于多軸負(fù)載條件下，或單獨進(jìn)行機(jī)械剪切或壓縮。

THP1-Blue 單核細(xì)胞在機(jī)械負(fù)載 3 天后，與壓縮和剪切的組合以及的單獨剪切相比，單獨壓縮條件顯著上調(diào)促炎標(biāo)志物NOS2和IL12B的基因表達(dá)水平（圖3）。IL6、IL-8、TNF- α、PTGS2、IL-10、CCL2和CCL18的基因表達(dá)水平在加載條件之間或與自由膨脹對照組相比沒有顯著差異。

然而，與對照相比，在從經(jīng)受壓縮和剪切組合以及單獨壓縮和剪切3 天的凝膠中收獲的細(xì)胞培養(yǎng)基中檢測到顯著增加的 TNF-α、IL-10、IL-8、IL-13 和 MDC 水平（圖4 A）。此外，與所有其他培養(yǎng)條件相比，單獨施加壓縮載荷顯著上調(diào)了單核細(xì)胞產(chǎn)生的 IL-1β，而單獨施加剪切增加了 MCP-1 的釋放。

與自由膨脹培養(yǎng)物相比，IL-6 和 IP-10 的水平在響應(yīng)任何加載條件時沒有顯著差異。除了調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生外，應(yīng)用壓縮和剪切或單獨剪切可誘導(dǎo) THP1-Blue 單核細(xì)胞釋放分泌的堿性磷酸酶，這表明 NF-κB 和 AP-1 轉(zhuǎn)錄因子被激活（圖4 B）。
 

圖3   THP1-Blue 單核細(xì)胞在單獨響應(yīng)多軸載荷、剪切或壓縮時表達(dá)的炎癥基因水平。通過實時 PCR 測量，THP1-Blue 單核細(xì)胞在單獨多軸加載、剪切或壓縮 3 天后的基因表達(dá)。

圖4   剪切和壓縮差異調(diào)節(jié) THP1-Blue 單核細(xì)胞的炎癥介質(zhì)表達(dá)。

（A）通過 ELISA 和多重測定法測量的多軸加載、剪切或壓縮 3 天后 THP1-Blue 單核細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥介質(zhì)水平。

（B）通過分光光度法測量，在加載 3 天后在細(xì)胞培養(yǎng)上清液中檢測到 SEAP 水平。

總之，該研究的結(jié)果表明，人類單核細(xì)胞對機(jī)械刺激有反應(yīng)，并觀察到剪切力和壓縮負(fù)荷對促炎介質(zhì)產(chǎn)生的調(diào)節(jié)作用。深入了解骨骼組織相關(guān)機(jī)械負(fù)荷對單核細(xì)胞行為的影響及其對局部細(xì)胞反應(yīng)和組織修復(fù)過程的后續(xù)影響，可能會發(fā)現(xiàn)新的策略，以最大化炎癥介導(dǎo)的修復(fù)機(jī)制。此外，研究結(jié)果可能為開發(fā)新的康復(fù)醫(yī)學(xué)策略以改善骨骼組織修復(fù)的治療結(jié)果提供見解。

參考文獻(xiàn)：Fahy N, Menzel U, Alini M, Stoddart MJ. Shear and Dynamic Compression Modulates the Inflammatory Phenotype of Human Monocytes in vitro. Front Immunol. 2019 Mar 5;10:383. doi: 10.3389/fimmu.2019.00383. PMID: 30891042; PMCID: PMC6411641.
圖片均來源于參考文獻(xiàn)

文章來源：http://www.naturethink.com/?news/238.html

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