斑馬魚呼吸代謝及行為分析技術(shù)在生態(tài)毒理學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用

      作為國(guó)際上廣受歡迎的模式動(dòng)物，斑馬魚除了易于養(yǎng)殖、性成熟周期短、產(chǎn)卵量大等特點(diǎn)之外，還具有受精卵體外發(fā)育、胚胎透明、易進(jìn)行化合物的高通量篩選等諸多獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，并且人類和斑馬魚之間生理和遺傳上均有高度同源性。

      此外，傳統(tǒng)應(yīng)用嚙齒類動(dòng)物的毒性測(cè)試受到越來(lái)越嚴(yán)苛的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理規(guī)定的挑戰(zhàn)，而應(yīng)用培養(yǎng)細(xì)胞的體外測(cè)試方法由于缺少生物體的復(fù)雜性限制了其實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的意義。因此斑馬魚為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的研究近年來(lái)越來(lái)越受到毒理學(xué)領(lǐng)域科研工作者的重視。不僅在探究污染物對(duì)水生生物的毒性效應(yīng)及其作用機(jī)制中發(fā)揮了重要作用，相關(guān)的數(shù)據(jù)還有助于評(píng)價(jià)污染物對(duì)哺乳動(dòng)物乃至人類的毒作用（孫立偉等，2018）。

 

      易科泰生態(tài)技術(shù)公司提供斑馬魚呼吸代謝測(cè)量與行為觀測(cè)全面解決方案，能夠在增塑劑、農(nóng)藥、重金屬、芳香族化合物、藥物等環(huán)境污染物對(duì)斑馬魚的毒理效應(yīng)和毒性機(jī)制研究中，為毒理學(xué)科研工作者提供必要的生理和行為性狀數(shù)據(jù)。涉及的具體儀器設(shè)備、功能及關(guān)鍵參數(shù)、應(yīng)用方向如下：

 

模塊1. 魚卵、胚胎、幼魚高通量呼吸代謝測(cè)量

      斑馬魚魚卵、胚胎、幼魚呼吸代謝測(cè)量由內(nèi)置氧氣感應(yīng)貼片的24孔板、氧氣測(cè)量主機(jī)、密封配件等組成，多個(gè)氧氣測(cè)量主機(jī)可串聯(lián)組成最多240個(gè)通道的高通量測(cè)量系統(tǒng)。

 

應(yīng)用案例：6PPD（輪胎抗氧化劑）及6PPD醌對(duì)斑馬魚幼魚的毒理效應(yīng)

      6PPD是在汽車輪胎和多種橡膠制品中廣泛使用的抗氧化劑。挪威諾德大學(xué)的研究人員調(diào)查了6PPD及6PPD醌對(duì)斑馬魚的急性毒性及對(duì)其形態(tài)、游泳行為、心率和耗氧率的影響。發(fā)現(xiàn)環(huán)境相關(guān)濃度不會(huì)造成顯著的毒性，而亞致死濃度則會(huì)引起發(fā)育、行為和心臟毒性(Varshney et al., 2022)。
耗氧率的測(cè)定采用了高通量呼吸代謝測(cè)量系統(tǒng)：在對(duì)溶解氧傳感器進(jìn)行兩點(diǎn)校準(zhǔn)后，將斑馬魚幼魚放入微孔中，每個(gè)孔兩條，于28℃恒溫條件下測(cè)定。發(fā)現(xiàn)暴露在PPD及其醌96h的斑馬魚幼魚氧氣消耗相比于對(duì)照組有所升高，并存在劑量和時(shí)間依賴性。

 

模塊2. 成魚呼吸代謝測(cè)量

      斑馬魚幼魚及成魚呼吸代謝測(cè)量系統(tǒng)采用了經(jīng)典的間歇式(Intermittent flow/stop-flow)測(cè)量法，兼具高時(shí)間分辨率和長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)的特點(diǎn)。針對(duì)斑馬魚體長(zhǎng)短、體重輕、耗氧量低等特點(diǎn)，采用了小型的呼吸室、水泵及非接觸式的光學(xué)氧氣傳感器，確保獲得可靠的耗氧曲線和耗氧率數(shù)據(jù)。系統(tǒng)具備自動(dòng)控制、測(cè)量和分析的功能，放入斑馬魚樣品、設(shè)置間歇測(cè)量各階段的時(shí)間后，系統(tǒng)即可自動(dòng)運(yùn)行和計(jì)算耗氧率，研究人員也可借助配套軟件計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)代謝率(SMR)等數(shù)據(jù)。

 

      易科泰公司提供同時(shí)自主集成的斑馬魚呼吸測(cè)量系統(tǒng)，可自動(dòng)切換小型水泵的開(kāi)閉狀態(tài)，實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化間歇式測(cè)量。溶解氧監(jiān)測(cè)采用了熒光光纖氧氣傳感器，具備高靈敏度和高分辨率，并且易安裝、零維護(hù)。

 

模塊3. 高通量視頻跟蹤及行為分析

      斑馬魚視頻跟蹤和行為分析系統(tǒng)由高清高幀頻工業(yè)相機(jī)、斑馬魚行為分析軟件、斑馬魚活動(dòng)室/池等組成。先錄制高質(zhì)量斑馬魚活動(dòng)視頻，再在計(jì)算機(jī)上使用專業(yè)行為分析軟件對(duì)視頻中的斑馬魚進(jìn)行分析，獲得其隨時(shí)間變化的行為軌跡（X坐標(biāo)和Y坐標(biāo)；單條斑馬魚可做3D跟蹤，包括X、Y、Z坐標(biāo)），最后自動(dòng)計(jì)算獲得數(shù)十種行為學(xué)參數(shù)。基于機(jī)器視覺(jué)的斑馬魚行為分析系統(tǒng)，能夠?qū)?4孔、48孔、96孔板中的斑馬魚進(jìn)行高通量行為采集和分析，使研究者輕松獲得大量行為數(shù)據(jù)。

 

應(yīng)用案例：SDHI類殺菌劑神經(jīng)毒性機(jī)制研究

      啶酰菌胺屬于線粒體呼吸鏈中琥珀酸輔酶Q 還原酶抑制劑（SDHI），是一類主要用于經(jīng)濟(jì)作物的廣譜殺真菌劑。因其降解緩慢，常在水樣甚至水生生物中被發(fā)現(xiàn)。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)的研究人員為探究啶酰菌胺的神經(jīng)毒性機(jī)制，測(cè)定了暴露處理后的斑馬魚幼魚和成魚的行為響應(yīng)、組織病理學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、生化參數(shù)和基因表達(dá)。發(fā)現(xiàn)啶酰菌胺可能通過(guò)損傷正常的視覺(jué)和神經(jīng)系統(tǒng)功能影響神經(jīng)行為表現(xiàn)(Qian, 2021)。

      魚類行為測(cè)試是評(píng)估環(huán)境污染物的神經(jīng)毒性的有效手段。本研究中使用了視頻跟蹤及行為分析系統(tǒng)，分別對(duì)慢性暴露在不同濃度啶酰菌胺下幼魚和成魚的活動(dòng)過(guò)程進(jìn)行了記錄，記錄前使其適應(yīng)新環(huán)境10min，持續(xù)記錄15min后，對(duì)視頻文件進(jìn)行分析，獲得了包括速度、加速度、移動(dòng)距離和活動(dòng)時(shí)間等行為參數(shù)。發(fā)現(xiàn)亞致死濃度啶酰菌胺慢性暴露下的幼魚以上4個(gè)行為參數(shù)均整體降低，并呈時(shí)間劑量依賴性。而暴露在高濃度（1.0mg/L）啶酰菌胺下21天的成魚平均速率、加速度受到抑制，但活動(dòng)時(shí)間和移動(dòng)距離顯著增加。因此，啶酰菌胺慢性暴露抑制了斑馬魚幼魚和成魚的運(yùn)動(dòng)能力。

 

模塊4. 游泳能力

      斑馬魚游泳能力研究測(cè)試系統(tǒng)為一站式方案，包括斑馬魚專用小型游泳室和自動(dòng)化水流速度控制、校準(zhǔn)的所有軟硬件。系統(tǒng)提供適合斑馬魚游泳匹配的高精度控制水流，水流調(diào)節(jié)速度為0.7 - 50 cm/s。

      該系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)水流速度的校準(zhǔn)、轉(zhuǎn)換、校正和控制，單位和方式任選（如以BL/sec為單位的游泳速度），可對(duì)Solid Blocking效應(yīng)（斑馬魚自身阻礙水流引起的水流速度變化）進(jìn)行校正，并且能夠創(chuàng)建自動(dòng)化的用戶自定義程序。

 

模塊5：游泳呼吸同步測(cè)定

      游泳呼吸同步測(cè)定系統(tǒng)是在模塊4的基礎(chǔ)上添加了斑馬魚間歇式呼吸測(cè)量功能，從而實(shí)現(xiàn)了游泳速度模擬和活動(dòng)代謝率測(cè)定的雙重功能。

 

應(yīng)用案例：多環(huán)芳烴不同暴露方式的亞致死效應(yīng)研究

      多環(huán)芳烴（PAHs）是普遍存在的環(huán)境污染物，它能夠引起多種魚類的發(fā)育毒性，但對(duì)成年魚類急性毒性的研究較少。為此，加拿大薩斯喀徹溫大學(xué)毒理學(xué)中心的研究人員對(duì)斑馬魚進(jìn)行了兩種方式的急性暴露——腹腔注射和水環(huán)境暴露（aqueous exposure），并測(cè)定了心臟功能、代謝率和有氧能力(Gerger, 2015)。后兩者使用了游泳呼吸同步測(cè)定系統(tǒng)。

該系統(tǒng)包括170mL的小型泳道、20L的水浴箱和呼吸代謝測(cè)量模塊，使用前對(duì)溶解氧傳感器進(jìn)行兩點(diǎn)校準(zhǔn)，并設(shè)定最低流速使斑馬魚適應(yīng)90min。之后以每20min遞增0.077m/s的增量提高流速，直到斑馬魚力竭（停止游泳最少2s），最后根據(jù)公式計(jì)算臨界游泳速度Ucrit。

      在測(cè)定Ucrit過(guò)程中，采用間歇式呼吸測(cè)量法，設(shè)定測(cè)量程序?yàn)?ldquo;1min交換-4min等待-5min測(cè)量”，直到氧氣含量低于90%空氣飽和度。根據(jù)耗氧率（MO2）—游泳速度的非線性曲線推導(dǎo)流速為零時(shí)的耗氧率，即為標(biāo)準(zhǔn)代謝率SMR。游泳速度最高時(shí)定義為活動(dòng)代謝率AMR。根據(jù)代謝率數(shù)據(jù)和臨界游泳速度計(jì)算了相對(duì)代謝空間（F-AS）和單位距離能耗（COT）。

      數(shù)據(jù)表明隨著游泳速度的增大，所有處理組MO2顯著增大，OCT顯著降低。Ucrit無(wú)顯著差異（未展示）。不同劑量的兩種方式暴露后的斑馬魚SMR顯著升高，AMR沒(méi)有顯著變化，F(xiàn)-AS顯著降低。以上結(jié)果表明兩種方式的多環(huán)芳烴暴露使斑馬魚基礎(chǔ)代謝提高以應(yīng)對(duì)毒物暴露并且有氧能力減弱。綜合其他方面的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)多環(huán)芳烴急性暴露對(duì)成年斑馬魚有顯著的亞致死效應(yīng)，尤其會(huì)對(duì)斑馬魚的有氧能力和心肺功能產(chǎn)生負(fù)面影響。

 
 
參考文獻(xiàn)
 
1.孫立偉, 靳遠(yuǎn)祥, 傅正偉,等. 基于斑馬魚的水生生態(tài)毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)體系的構(gòu)建[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào), 2018, 13(2):6.
2.Bambino, K., and Chu, J. (2017). Zebrafish in Toxicology and Environmental Health. In Current Topics in Developmental Biology, (Elsevier), pp. 331–367.
3.Gerger, C.J. (2015). Comparison of the acute effects of benzo-a-pyrene on adult zebrafish (Danio rerio) cardiorespiratory function following intraperitoneal injection versus aqueous exposure. Aquatic Toxicology 165: 19-30.
4.Qian, L. (2021). Environmentally relevant concentrations of boscalid exposure affects the neurobehavioral response of zebrafish by disrupting visual and nervous systems. Journal of Hazardous Materials 404, 124083.
5.Varshney, S., Gora, A.H., Siriyappagouder, P., Kiron, V., and Olsvik, P.A. (2022). Toxicological effects of 6PPD and 6PPD quinone in zebrafish larvae. Journal of Hazardous Materials 424, 127623.