柯薩奇病毒和腺病毒受體介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞對流體剪切應(yīng)力的反應(yīng)

內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）通過血流不斷暴露于流體剪切應(yīng)力（FSS）。剪切應(yīng)力通過刺激由 PECAM-1、血管內(nèi)皮鈣粘蛋白（VE-cadherin）和血管內(nèi)皮生長因子受體2（VEGFR2）組成的機(jī)械感覺復(fù)合物來調(diào)節(jié) EC 功能。此外，一些內(nèi)皮蛋白或結(jié)構(gòu)，包括細(xì)胞-細(xì)胞連接分子、整合素、離子通道和細(xì)胞骨架，都參與了機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)。這種機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)信號是各種內(nèi)皮功能所必需的，例如增殖、血管生成、遷移、血管舒張和炎癥。

柯薩奇病毒和腺病毒受體（CAR）是 B 組柯薩奇病毒和 C 亞組腺病毒的病毒受體，普通存在于心肌細(xì)胞表面。心肌中 CAR 表達(dá)增加與心肌病相關(guān)。在 ECs 中，炎性細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子α（TNF-α）和干擾素γ（IFN-γ），下調(diào) CAR 表達(dá)和 CAR 介導(dǎo)的中性粒細(xì)胞的跨內(nèi)皮遷移。盡管對 CAR 作為病毒受體的功能已有相當(dāng)多的了解，但在剪切應(yīng)力下 CAR 在 ECs 中的表達(dá)模式和生理作用仍不清楚。

因此，韓國梨花女子大學(xué)醫(yī)學(xué)研究所、生命科學(xué)系、中原大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程系的課題組的一項(xiàng)研究展示了 CAR 在 FSS 條件下在血管內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）中的表達(dá)、調(diào)控機(jī)制和作用。文章名為《Coxsackievirus and adenovirus receptor mediates the responses of endothelial cells to fluid shear stress》。

實(shí)驗(yàn)使用單向穩(wěn)定流（20 dyne/cm2 的剪切應(yīng)力）用于 LSS 和雙向擾動流（±5 dyne/cm2的剪切應(yīng)力）用于振蕩剪切應(yīng)力（OSS）。在 LSS 和 OSS 之間的交叉實(shí)驗(yàn)中，HUVECs 暴露于 LSS 或 OSS 24 小時(shí)，然后暴露于其他類型的剪切應(yīng)力 24 小時(shí)。

FSS 調(diào)節(jié) ECs 中的 CAR 表達(dá)
首先通過測量受到 LSS 或擾動流的 HUVECs 中CAR 表達(dá)來研究 FSS 是否調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞 CAR 的表達(dá)。有趣的是，干擾流上調(diào)，而 LSS 下調(diào)，CAR 在 mRNA和蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)。通過蛋白質(zhì)印跡檢測 CAR 蛋白顯示兩條條帶，一條為約 40 kDa，一條為 46 kDa。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn) FSS 模式的變化主要調(diào)節(jié) CAR 的表達(dá)，由 40 kDa 的條帶表示。

為了研究 FSS 對體內(nèi)內(nèi)皮 CAR 表達(dá)的影響，通過en face 染色評估了自然暴露于各種血流模式的小鼠主動脈組織中的 CAR 的表達(dá)。CAR 在擾流的小彎側(cè)（LC）區(qū)域的表達(dá)高于暴露于 LSS 的胸主動脈（TA）區(qū)域。如 z-stack 表面成像所示，擾流區(qū)域中的 CAR 表達(dá)主要位于內(nèi)皮的管腔表面。

接下來研究了人體動脈組織中的內(nèi)皮 CAR 表達(dá)。與小鼠主動脈組織一致，暴露于干擾流的區(qū)域比暴露于正常層流的區(qū)域顯示出更高水平的 CAR 表達(dá)。

ECs中的CAR表達(dá)受流量敏感的KLF2/AP-1軸調(diào)節(jié)
KLF2 是一種血流響應(yīng)性關(guān)鍵剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子，控制許多流量調(diào)節(jié)的內(nèi)皮基因的表達(dá)。剪切應(yīng)力處理后，CAR表達(dá)與KLF2表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。因此假設(shè)，KLF2 調(diào)節(jié) ECs 中的 CAR 表達(dá)。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，評估了轉(zhuǎn)染 KLF2 或編碼 KLF2 的質(zhì)粒的 siRNA 的 HUVECs 中的 CAR 表達(dá)。

正如預(yù)期的那樣，在 LSS 下減少的 CAR 表達(dá)在 KLF2 沉默時(shí)增加。相反，當(dāng) KLF2 過表達(dá)時(shí)，OSS 下增加的 CAR 表達(dá)減少。此外，KLF2 通過抑制 AP-1和核因子kappa B（NF-κB）的激活來下調(diào)促炎基因的表達(dá)。

為了研究流動條件下 AP-1 是否與 CAR 表達(dá)相關(guān)，用 AP-1 抑制劑 SR11302 預(yù)處理后將 HUVECs 暴露于剪切應(yīng)力。AP-1抑制降低了OSS中的CAR上調(diào)。與這一發(fā)現(xiàn)一致，當(dāng) AP-1 復(fù)合物的成分 c-Jun 和 c-Fos 被沉默時(shí)，OSS 下增加的 CAR 表達(dá)降低。

接下來檢查了 KLF2 對 CAR 的抑制是否由 AP-1 激活阻斷介導(dǎo)。為了檢測 KLF2 對 AP-1 激活的影響，評估了 KLF2 過表達(dá)或敲低后 HUVECs 中 c-Jun 和 c-Fos 的表達(dá)。KLF2過表達(dá)消除了OSS誘導(dǎo)的c-Jun和c-Fos mRNA水平的增加，而LSS條件下的KLF2敲低細(xì)胞顯示出c-Jun和c-Fos的mRNA水平高于LSS 條件下的細(xì)胞。與 LSS 下相比，OSS 始終增強(qiáng) AP-1 啟動子活性。然而，KLF2過表達(dá)抑制了OSS誘導(dǎo)的AP-1啟動子活性增加。因此，CAR 在 ECs 中的表達(dá)受流量響應(yīng)性 KLF2/AP-1 軸的調(diào)節(jié)。

CAR敲低抑制ECs中擾流誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)
擾流通過激活 NF-κB 通路誘導(dǎo)內(nèi)皮炎癥。NF-κB 的激活是由抑制亞基 IκB 的磷酸化和 NF-κB p65 的核轉(zhuǎn)位介導(dǎo)的。為了探索 CAR 在 ECs 中的作用，確定了 CAR 對擾動流誘導(dǎo)的 NF-κB 活化的影響。IκB 的磷酸化和 NF-κB p65 的核轉(zhuǎn)位在 OSS 中增加，但這種增加被 CAR 敲低抑制。

接下來探討了 CAR 對 NF-κB 下游信號傳導(dǎo)的影響：抗炎 eNOS 基因和促炎基因的表達(dá)，例如CAR 敲低的 HUVECs 中血管細(xì)胞粘附分子1（VCAM-1）和細(xì)胞間粘附分子1（ICAM-1）。eNOS 在 mRNA 處和蛋白質(zhì)水平上顯著下調(diào)，而與LSS相比，在OSS下VCAM-1和ICAM-1上調(diào)。有趣的是，通過 CAR 敲低，OSS 介導(dǎo)的 eNOS 表達(dá)減少升高，而 OSS 下 VCAM-1 和 ICAM-1 水平的增加被 CAR 敲低抑制。

為了評估 CAR 敲低介導(dǎo)的 OSS 誘導(dǎo)的粘附分子水平降低的功能相關(guān)性，評估了單核細(xì)胞對 HUVECs 的粘附。CAR敲低抑制了OSS誘導(dǎo)的單核細(xì)胞對ECs的粘附增加。

CAR缺失對擾流下的致動脈粥樣硬化內(nèi)皮具有保護(hù)作用
接下來，通過在 C57BL6 背景上生成 EC 特異性 CAR KO 小鼠并利用部分頸動脈結(jié)扎作為干擾流誘導(dǎo)的動脈粥樣硬化模型，來確定CAR缺失對體內(nèi)內(nèi)皮細(xì)胞的影響。在部分頸動脈結(jié)扎 3 天后，評估了野生型（WT）和 EC 特異性 CAR KO 小鼠中抗炎基因和促炎基因的表達(dá)。從頸動脈內(nèi)皮中分離出總 RNA，經(jīng)RT-PCR檢測，證實(shí)存在內(nèi)皮特異性標(biāo)志物（PECAM-1），而不存在平滑肌細(xì)胞特異性標(biāo)志物（α-SMA）。RT-PCR 證實(shí)了 ECs 中的有效 CAR KO。

在WT小鼠中，與具有正常層流的未結(jié)扎的右頸動脈（RCA）相比，結(jié)扎的左頸動脈（LCA）中的CAR表達(dá)上調(diào)，這與體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致。同樣，通過實(shí)時(shí) PCR 和免疫組織化學(xué)評估，在結(jié)扎的 LCA 中，抗炎標(biāo)志物 eNOS 的水平顯著降低，而促炎標(biāo)志物 VCAM-1 和 ICAM-1 的水平升高。然而，在干擾流下 EC 特異性 CAR KO 小鼠中，沒有觀察到 VCAM-1 和 ICAM-1 水平的增加。eNOS 表達(dá)的減少比在具有結(jié)扎 LCA 的 WT 小鼠中觀察到的要少。

在部分頸動脈結(jié)扎和食用西方飲食后 4 周，WT 小鼠的頸動脈粥樣硬化的替代標(biāo)志物—內(nèi)膜中層厚度（IMT）增加。相比之下，EC 特異性 CAR KO 小鼠的 IMT 降低（圖4 d）。此外，比較了人體動脈組織正常和動脈粥樣硬化區(qū)域的內(nèi)皮 CAR 表達(dá)。正如預(yù)期的那樣，動脈粥樣硬化斑塊區(qū)域的CAR表達(dá)水平高于正常動脈區(qū)域。

總之，結(jié)果表明，CAR 缺失通過阻斷暴露于干擾血流的 ECs 中的炎癥反應(yīng)發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用，并且 CAR 在頸動脈結(jié)扎后觀察到的 IMT 增加中起重要作用。
 

CAR通過調(diào)節(jié)PECAM-1磷酸化調(diào)節(jié)FSS誘導(dǎo)的內(nèi)皮機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)
為了探索 CAR 在 ECs 對剪切應(yīng)力響應(yīng)中的機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)信號傳導(dǎo)功能，評估了 Src、PI3K、Akt 和 eNOS 在轉(zhuǎn)染 siCAR 或質(zhì)粒編碼 CAR 的 HUVECs 中的磷酸化。LSS 誘導(dǎo) Src（pY416，活性形式）、PI3K、Akt 和 eNOS 的激活，而 OSS 不激活這些分子。在 Src 磷酸化方面，與 LSS 相比，OSS 中 Src 的 Y527 抑制形式增加。CAR 敲低逆轉(zhuǎn)了 OSS 中 Src（Y416）、PI3K、Akt 和 eNOS 的磷酸化降低，而 Src（Y527）的磷酸化受到抑制。相反，CAR過表達(dá)消除了Src（Y416）、PI3K、Akt和eNOS的激活以及LSS誘導(dǎo)的Src磷酸化（Y527）的降低。

為了確定 CAR 對 PECAM-1 磷酸化的影響，評估了 PECAM-1 免疫沉淀物中的酪氨酸磷酸化。通過CAR敲低恢復(fù)了OSS下PECAM-1的磷酸化降低，而CAR過表達(dá)消除了LSS下增強(qiáng)的PECAM-1磷酸化。使用共聚焦顯微鏡，發(fā)現(xiàn) CAR 與 PECAM-1 共定位。因此，通過基于免疫染色的原位鄰近連接測定（PLA）研究了 CAR 與暴露于擾動流的 HUVECs 中機(jī)械感覺復(fù)合物之間的內(nèi)源性蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。PLA揭示了在OSS下表達(dá)增加的CAR與HUVECs中的機(jī)械感覺復(fù)合物物理相關(guān)性。

總之，這些發(fā)現(xiàn)表明CAR與ECs中的PECAM-1和其他機(jī)械感覺復(fù)合物蛋白具有密切的物理關(guān)系，并且在FSS條件下，通過CAR與機(jī)械感覺復(fù)合物或其他蛋白質(zhì)之間的相互作用，PECAM-1的磷酸化受CAR調(diào)控。

用針對 CAR的 siRNA（a、c、e）或編碼 CAR 的標(biāo)記質(zhì)粒（b、c）轉(zhuǎn)染的 HUVECs 暴露于 FSS。評估 Src 在 Y416（活性形式）和 Y527（抑制形式）、PI3K、Akt 和 eNOS（S1177）處的磷酸化。

內(nèi)皮 CAR 表達(dá)受 FSS 調(diào)節(jié)。擾動流增加，層流剪切應(yīng)力降低，ECs 中的 CAR 表達(dá)，CAR 表達(dá)的這些變化是通過 KLF2-AP-1 軸調(diào)節(jié)的。擾流誘導(dǎo)的 CAR 抑制 PECAM-1 的磷酸化，導(dǎo)致通過磷酸化 Src、PI3K、Akt 和 eNOS 抑制內(nèi)皮機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)信號。因此，CAR 通過阻斷 PECAM-1 磷酸化來調(diào)節(jié) ECs 中的機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而影響內(nèi)皮功能和血管病理生理學(xué)。

總之，這項(xiàng)研究提供了新的證據(jù)，表明 FSS 調(diào)節(jié) ECs 中的 CAR 表達(dá)，并且擾動流通過 KLF2/AP-1 途徑上調(diào) CAR。抑制 CAR 表達(dá)通過抑制 NF-κB 活化來下調(diào)促炎基因的表達(dá)，從而減少體外和體內(nèi)流動紊亂下的內(nèi)皮炎癥，然后延遲動脈粥樣硬化形成。CAR 抑制 PECAM-1 的磷酸化，從而抑制內(nèi)皮機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)信號。這些結(jié)果表明，CAR 是 ECs 中機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要調(diào)節(jié)劑，通過阻斷 PECAM-1 磷酸化發(fā)揮作用，從而影響內(nèi)皮功能和血管病理生理學(xué)。因此，CAR參與了血管功能的維護(hù)，并有望成為治療血流紊亂性血管疾�。ㄈ鐒用}粥樣硬化）的靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：Chung J, Kim KH, An SH, Lee S, Lim BK, Kang SW, Kwon K. Coxsackievirus and adenovirus receptor mediates the responses of endothelial cells to fluid shear stress. Exp Mol Med. 2019 Nov 27;51(11):1-15. doi: 10.1038/s12276-019-0347-7. PMID: 31776326; PMCID: PMC6881322.

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