平行生物反應(yīng)器助力畢赤酵母細(xì)胞工廠高效合成α-檀香烯

檀香烯是倍半萜類具有代表性的化合物之一，也是檀香精油的主要成分，在醫(yī)藥、食品、香料等領(lǐng)域有著重要的應(yīng)用。由于天然檀香資源十分有限，且難以獲得，合成生物學(xué)方法利用微生物細(xì)胞工廠大規(guī)模生產(chǎn)檀香烯成為解決這一難題的新思路。Establishing Komagataella phaffii as a Cell Factory for Efficient Production of Sesquiterpenoid α-Santalene浙江大學(xué)連佳長(zhǎng)課題組首次利用畢赤酵母細(xì)胞工廠高效合成倍半萜類化合物α-檀香烯。
研究通過優(yōu)化啟動(dòng)子，促進(jìn)了α-檀香烯合成酶基因（SAS） 表達(dá)、甲羥戊酸（MVA）途徑關(guān)鍵基因的過表達(dá)，以及SAS多拷貝整合構(gòu)建工程菌株。結(jié)合培養(yǎng)基和生物工藝優(yōu)化，后的工程菌株（STE-9）能夠在搖瓶、分批發(fā)酵和補(bǔ)料分批發(fā)酵中分別生產(chǎn)滴度高達(dá)829.8 ± 70.6 mg/L，4.4 ± 0.3 g/L和21.5 ± 1.6 g/L的檀香烯。  
構(gòu)建產(chǎn)α-檀香烯畢赤酵母株
首先實(shí)驗(yàn)將密碼子優(yōu)化的α-檀香烯合成酶基因（SAS）引入畢赤酵母中使其能夠生產(chǎn)α-檀香烯。在一系列組成型啟動(dòng)子和甲醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子中，TEF1p菌株（STE-1）的α-檀香烯產(chǎn)量更高。以釀酒酵母工程菌株對(duì)照進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，證明畢赤酵母在表達(dá)外源基因和合成萜類化合物方面具有優(yōu)勢(shì)。
MVA途徑基因過表達(dá)和SAS多拷貝整合提高產(chǎn)量
提高M(jìn)VA途徑的代謝通量是提高萜類化合物產(chǎn)量的有效策略。將tHMG1和IDI1-ERG20整合到STE-1的基因組中，分別獲得工程菌STE-3和STE-5。同時(shí)過表達(dá)tHMG1和IDI1-ERG20（STE-6）使α-檀香烯的產(chǎn)量增加到246.9 ± 33.8 mg/L，約為STE-1的2.74倍。由于乙酰輔酶A是MVA途徑的直接前體，乙酰輔酶A合成酶基因（ACS*）的過表達(dá)使α-檀香烯的產(chǎn)量進(jìn)一步提高到282.4 ± 44.1 mg/L。

為了進(jìn)一步提高α-檀香烯的產(chǎn)量，構(gòu)建了含有SAS多拷貝的畢赤酵母工程菌。將SAS的額外拷貝整合到STE-1、STE-3和STE-7中，獲得工程菌STE-2、STE-4和STE-8，α-檀香烯產(chǎn)量分別是其單拷貝菌株的1.9倍、1.55倍和1.56倍。隨著SAS拷貝數(shù)的增加，發(fā)現(xiàn)3個(gè)拷貝SAS的菌株更為適宜。
 
培養(yǎng)基優(yōu)化提高產(chǎn)量
進(jìn)一步通過培養(yǎng)基組分優(yōu)化提高產(chǎn)物產(chǎn)量。選擇4種不同的蛋白胨測(cè)試對(duì)α-檀香烯生物合成的影響。搖瓶發(fā)酵YP1D組α-檀香烯產(chǎn)量更高，達(dá)829.8 ± 70.6 mg/L。YP1D為更適合的培養(yǎng)基組分。
T&J-MInibox 平行生物反應(yīng)器發(fā)酵提高產(chǎn)量
將優(yōu)化后的工程菌株STE-9用于1-L發(fā)酵罐（MInibox，迪必爾生物工程（上海）有限公司）的分批和補(bǔ)料分批發(fā)酵對(duì)照研究，以便選擇更合適的培養(yǎng)策略。補(bǔ)料分批發(fā)酵種，種子被接種至含有600 mL YP1D培養(yǎng)基的發(fā)酵罐。發(fā)酵溫度控制在30°C，DO 100%，罐體壓力保持在0.8個(gè)大氣壓。24 h后，發(fā)酵罐中加入10%（v/v）正十二烷。當(dāng)葡萄糖濃度減少至1 g/L時(shí)，進(jìn)行恒速補(bǔ)料，攪拌速率維持在200-800 rpm，DO約20%。在發(fā)酵后期對(duì)pH進(jìn)行調(diào)節(jié)，并定期測(cè)定OD600、葡萄糖濃度、乙醇濃度和產(chǎn)物濃度。
在分批發(fā)酵罐中，α-檀香烯的產(chǎn)量為4.4 ± 0.3 g/L，而在補(bǔ)料分批發(fā)酵罐中，α-檀香烯的產(chǎn)量高達(dá)到21.5 ± 1.6 g/L。補(bǔ)料分批發(fā)酵顯著提高產(chǎn)量。該研究利用迪必爾生物反應(yīng)器成功打破了目前為止報(bào)道的α-檀香烯的合成紀(jì)錄，證明了合成生物學(xué)方法利用畢赤酵母細(xì)胞工廠在生產(chǎn)萜類化合物和其他天然珍貴產(chǎn)物上的優(yōu)勢(shì)。

參考文獻(xiàn)：
1、Zuo Y, Xiao F, Gao J, Ye C, Jiang L, Dong C, Lian J. Establishing Komagataella phaffii as a Cell Factory for Efficient Production of Sesquiterpenoid α-Santalene. J Agric Food Chem. 2022 Jun 21. doi: 10.1021/acs.jafc.2c02353. Epub ahead of print. PMID: 35729733.
2、https://mp.weixin.qq.com/s/QHQERgNHVE5LHtkULgkvHA