Nature & Cell文獻解析：揭示CAR-T開發(fā)新思路
嵌合抗原受體T細胞免疫療法，CAR-T療法。目前已在血液系統(tǒng)惡性腫瘤的治療中取得了重大成功，但也存在嚴重的可能致命的副作用，例如細胞因子風暴CRS和神經(jīng)毒性。同時，CAR-T療法目前對實體瘤治療效果非常有限，且腫瘤相關抗原在很多重要且關鍵的正常組織都有表達，這也增加了“On target off tumor”的毒性。
針對CAR-T療法的局限性，研究人員采取了許多策略試圖克服這些局限性，例如增強T細胞的擴增和降低T細胞的耗竭、敲除抑制基因、提高T細胞識別抗原的靈敏度。本期陳老濕給大家?guī)韮善狢NS文章，為開發(fā)兼具安全性和有效性的CAR-T療法提供思路。
過表達c-Jun的CAR-T細胞有效地抵抗了耗竭過程，那么是否會影響CAR-T細胞的殺傷活性呢？研究人員采用了Incucyte® 高通量實時活細胞分析系統(tǒng)對修飾后的CAR-T細胞進行了殺傷活性分析，將GFP+的靶細胞與CAR-T細胞接種于96孔板共培養(yǎng)，每2-3小時自動成像分析。Incucyte® 高通量活細胞分析系統(tǒng)具有無需取出細胞、無需同位素或抗體標記、免清洗、提供圖像證據(jù)等優(yōu)點，因此分析期間不需要進行任何的操作，實驗結束后通過軟件分析的Total integrated GFP intensity進行殺傷活性分析。
針對Nalm6靶細胞CAR-T以及過表達c-Jun的CAR-T細胞都表現(xiàn)出很好的殺傷活性，但是在低表達靶抗原的Nalm6-F靶細胞中，過表達c-Jun的CAR-T細胞表現(xiàn)出了更好的殺傷活性。
并且在低的效靶比的情況下，過表達c-Jun的CAR-T細胞依然可以維持更好的殺傷活性。并且在后期的小鼠體內腫瘤模型也顯示了類似的結果。該文章利用在體外構建的T細胞耗竭模型，發(fā)現(xiàn)了c-Jun在T細胞耗竭中的作用，過表達c-Jun可以使CAR T細胞抵抗耗竭，發(fā)揮更強的腫瘤殺傷效果。
2022年4月27號，斯坦福大學醫(yī)學院的Crystal L. Mackall教授課題組再次在《Cell》雜志上發(fā)表最新的研究成果[2]，利用FDA已批準的小分子藥物設計和開發(fā)了可調控的CAR系統(tǒng)，該系統(tǒng)基于可抑制蛋白酶進行的信號中和（SNIP），在基礎狀態(tài)下NS3p蛋白酶切割CAR分子使其失活（Off狀態(tài)），SNIP CAR-T細胞暴露于NS3p抑制劑GPV，NS3p活性被抑制從而阻斷其切割CAR分子，CAR分子的功能不受影響（on狀態(tài)）。
研究人員設計了不同版本的SNIP CAR-T細胞，為了快速準確地評估不同版本的CAR-T細胞的殺傷活性，研究人員同樣使用了Incucyte® 檢測了SNIP CAR-T針對靶細胞的殺傷活性，以及藥物對SNIP CAR-T細胞的調控活性。Incucyte® 的分析結果顯示SNIP系統(tǒng)在Off狀態(tài)下沒有明顯的“泄露”活性，在ON狀態(tài)下具有腫瘤殺傷活性且強于組成型的CAR-T細胞。
研究人員結合了RNA測序、單細胞測序、質譜流式等分析手段，發(fā)現(xiàn)在Off狀態(tài)下的CAR-T細胞一旦被激活具有更強和更快的腫瘤殺傷動力學。并且調整給藥可調整SNIP的活性為CAR-T細胞治療打開了新的治療窗口。多種不同的小鼠模型包括原位實體瘤模型也證實了SNIP CAR-T的有效性和安全性。
本研究基于FDA批準的小分子藥物設計和開發(fā)了SNIP CAR-T平臺，與傳統(tǒng)的CAR-T平臺相比具有更好的安全性和有效性。
免疫細胞腫瘤殺傷活性的體外評價過程涉及到免疫細胞和腫瘤細胞兩種細胞共培養(yǎng)，因此不能采用傳統(tǒng)的細胞增殖活性檢測手段（如MTT、ATP等方法）直接進行檢測。目前常用的免疫細胞殺傷研究方法包括51鉻釋放試驗、流式細胞術、3H 胸腺嘧啶和 ATP 檢測。這些方法步驟繁瑣，耗費時間和人力，很難實現(xiàn)對效應細胞和靶細胞之間相互作用的研究。
Incucyte® 位于細胞培養(yǎng)箱內，可以長時程自動采集相差和熒光圖片，實時觀察并全自動分析腫瘤細胞殺傷和免疫細胞與腫瘤細胞之間的相互作用，配合Cell-By-Cell軟件模塊可以自動地完成圖片的定量分析，直接測定腫瘤細胞的死亡及活力。
獲取相關資源
-參考文獻-
c-Jun
提高CAR-T的有效性
提高CAR-T的有效性
2019年12月4號，斯坦福大學醫(yī)學院Crystal L. Mackall教授課題組在《Nature》雜志發(fā)表的文章，揭示了CAR-T細胞中c-Jun過表達誘導T細胞耗竭抵抗[1]。研究人員構建了T細胞耗竭模型，通過ATAC-Seq技術，精確定位調節(jié)過表達或表達不足的基因組區(qū)域，找到了c-Jun基因。研究人員最終發(fā)現(xiàn)過表達經(jīng)典AP-1因子c-Jun的CAR-T細胞具有增強擴增潛能、減少終末分化和提高抗腫瘤的效力。
過表達c-Jun的CAR-T細胞誘導T細胞的耗竭抵抗
過表達c-Jun的CAR-T細胞有效地抵抗了耗竭過程，那么是否會影響CAR-T細胞的殺傷活性呢？研究人員采用了Incucyte® 高通量實時活細胞分析系統(tǒng)對修飾后的CAR-T細胞進行了殺傷活性分析，將GFP+的靶細胞與CAR-T細胞接種于96孔板共培養(yǎng)，每2-3小時自動成像分析。Incucyte® 高通量活細胞分析系統(tǒng)具有無需取出細胞、無需同位素或抗體標記、免清洗、提供圖像證據(jù)等優(yōu)點，因此分析期間不需要進行任何的操作，實驗結束后通過軟件分析的Total integrated GFP intensity進行殺傷活性分析。
針對Nalm6靶細胞CAR-T以及過表達c-Jun的CAR-T細胞都表現(xiàn)出很好的殺傷活性，但是在低表達靶抗原的Nalm6-F靶細胞中，過表達c-Jun的CAR-T細胞表現(xiàn)出了更好的殺傷活性。
并且在低的效靶比的情況下，過表達c-Jun的CAR-T細胞依然可以維持更好的殺傷活性。并且在后期的小鼠體內腫瘤模型也顯示了類似的結果。該文章利用在體外構建的T細胞耗竭模型，發(fā)現(xiàn)了c-Jun在T細胞耗竭中的作用，過表達c-Jun可以使CAR T細胞抵抗耗竭，發(fā)揮更強的腫瘤殺傷效果。
蛋白酶抑制系統(tǒng)
提高CAR-T的安全性
提高CAR-T的安全性
2022年4月27號，斯坦福大學醫(yī)學院的Crystal L. Mackall教授課題組再次在《Cell》雜志上發(fā)表最新的研究成果[2]，利用FDA已批準的小分子藥物設計和開發(fā)了可調控的CAR系統(tǒng)，該系統(tǒng)基于可抑制蛋白酶進行的信號中和（SNIP），在基礎狀態(tài)下NS3p蛋白酶切割CAR分子使其失活（Off狀態(tài)），SNIP CAR-T細胞暴露于NS3p抑制劑GPV，NS3p活性被抑制從而阻斷其切割CAR分子，CAR分子的功能不受影響（on狀態(tài)）。
SNIP工作機理
研究人員設計了不同版本的SNIP CAR-T細胞，為了快速準確地評估不同版本的CAR-T細胞的殺傷活性，研究人員同樣使用了Incucyte® 檢測了SNIP CAR-T針對靶細胞的殺傷活性，以及藥物對SNIP CAR-T細胞的調控活性。Incucyte® 的分析結果顯示SNIP系統(tǒng)在Off狀態(tài)下沒有明顯的“泄露”活性，在ON狀態(tài)下具有腫瘤殺傷活性且強于組成型的CAR-T細胞。
研究人員結合了RNA測序、單細胞測序、質譜流式等分析手段，發(fā)現(xiàn)在Off狀態(tài)下的CAR-T細胞一旦被激活具有更強和更快的腫瘤殺傷動力學。并且調整給藥可調整SNIP的活性為CAR-T細胞治療打開了新的治療窗口。多種不同的小鼠模型包括原位實體瘤模型也證實了SNIP CAR-T的有效性和安全性。
本研究基于FDA批準的小分子藥物設計和開發(fā)了SNIP CAR-T平臺，與傳統(tǒng)的CAR-T平臺相比具有更好的安全性和有效性。
關于免疫細胞腫瘤殺傷活性分析
免疫細胞腫瘤殺傷活性的體外評價過程涉及到免疫細胞和腫瘤細胞兩種細胞共培養(yǎng)，因此不能采用傳統(tǒng)的細胞增殖活性檢測手段（如MTT、ATP等方法）直接進行檢測。目前常用的免疫細胞殺傷研究方法包括51鉻釋放試驗、流式細胞術、3H 胸腺嘧啶和 ATP 檢測。這些方法步驟繁瑣，耗費時間和人力，很難實現(xiàn)對效應細胞和靶細胞之間相互作用的研究。
Incucyte® 高通量實時活細胞分析系統(tǒng)
Incucyte® 位于細胞培養(yǎng)箱內，可以長時程自動采集相差和熒光圖片，實時觀察并全自動分析腫瘤細胞殺傷和免疫細胞與腫瘤細胞之間的相互作用，配合Cell-By-Cell軟件模塊可以自動地完成圖片的定量分析，直接測定腫瘤細胞的死亡及活力。
獲取相關資源
《實時活細胞分析開啟免疫細胞殺傷實驗新格局》
了解更多免疫細胞殺傷的實時動態(tài)分析策略
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《免疫細胞殺傷實時動態(tài)分析》
（中文字幕）
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講座主要內容
- 腫瘤特異性T細胞的細胞毒性研究技術背景介紹；
- 免疫細胞殺傷的實時動態(tài)分析應用及結果分析；
- 細胞殺傷的特異性控制及建立
主講嘉賓
Dr. Anne Lodge
首席科學家，Cellero（于2020年被Charles River收購）
首席科學家，Cellero（于2020年被Charles River收購）
-參考文獻-
- Lynn, R.C., Weber, E.W., Sotillo, E., Gennert, D., Xu, P., Good, Z., Anbunathan, H., Lattin, J., Jones, R., Tieu, V., et al. (2019). C-Jun overexpression in CAR T cells induces exhaustion resistance. Nature 576, 293–300.
- Labanieh L, Majzner RG, Klysz D, Sotillo E, Fisher CJ, Vilches-Moure JG, Pacheco KZB, Malipatlolla M, Xu P, Hui JH, Murty T, Theruvath J, Mehta N, Yamada-Hunter SA, Weber EW, Heitzeneder S, Parker KR, Satpathy AT, Chang HY, Lin MZ, Cochran JR, Mackall CL. Enhanced safety and efficacy of protease-regulated CAR-T cell receptors. Cell. 2022 Apr 20:S0092-8674(22)00391-9.
來源：德國賽多利斯集團
聯(lián)系電話：實驗室產(chǎn)品與服務事業(yè)部：400 920 9889 / 生物工藝解決方案事業(yè)部：400 680 1870
E-mail：info.cn@sartorius.com
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