細(xì)胞轉(zhuǎn)染新方法-免疫穿孔轉(zhuǎn)染法的原理及過(guò)程

細(xì)胞轉(zhuǎn)染現(xiàn)在是分子生物學(xué)的核心技術(shù)，也是基因制藥的必要前提。免疫穿孔轉(zhuǎn)染法技術(shù)是用涂有抗體并與特定細(xì)胞表面跨膜蛋白結(jié)合的珠子如何在移除珠子時(shí)在細(xì)胞中產(chǎn)生孔，從而允許用 DNA 或其他大分子轉(zhuǎn)染細(xì)胞。這種通過(guò)免疫穿孔對(duì)細(xì)胞進(jìn)行的獨(dú)特靶向轉(zhuǎn)染非常有效，并且減少細(xì)胞凋亡。
免疫穿孔轉(zhuǎn)染法的原理

轉(zhuǎn)染細(xì)胞有多種方法，比如電穿孔 、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染 、磷酸鈣共沉淀 和 DEAE葡聚糖等方法 . 在這些方法中，只有電穿孔提供了將 DNA 和其他分子（如蛋白質(zhì)）引入活細(xì)胞的可能性。目前的方法都不能針對(duì)特定類型的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在這種新的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法中，抗體包被的珠子與特定的表面抗原結(jié)合，然后通過(guò)混合將珠子從細(xì)胞中剪下：這會(huì)在細(xì)胞膜上形成瞬時(shí)孔，大分子可以通過(guò)這些孔進(jìn)入。粒細(xì)胞、分化的人淋巴母細(xì)胞 HL-60 細(xì)胞通常在其表面表達(dá) CD71。當(dāng)在二甲基亞砜 (DMSO) 存在下誘導(dǎo)分化時(shí)，細(xì)胞停止表達(dá) CD71，而是表達(dá) CD11b。

免疫穿孔細(xì)胞轉(zhuǎn)染法的基本過(guò)程
將涂有抗 CD11b 抗體 (DYNAFECT-CD11b) 或抗 CD71 抗體 (DYNAFECT-CD71) 的 DYNAFECT 珠子在旋轉(zhuǎn)的上下混合器上以 33 rpm 在 22 °C 下混合 6 小時(shí)，與未誘導(dǎo)的 HL- 60 個(gè)細(xì)胞或用 DMSO 誘導(dǎo) 3 天的細(xì)胞。為了在 2-ml 微量離心管中混合，可將 10 7 個(gè)磁珠和 5×10 5 個(gè)細(xì)胞懸浮在含有 0.2 μg 編碼綠色熒光蛋白的質(zhì)粒 DNA 載體 pEGFP-C1（4.7 kb）的 0.5 ml 轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基（Dynal AS）中。轉(zhuǎn)染后，使用磁力分離器去除磁珠，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移回組織培養(yǎng)基中并在分析前再培養(yǎng) 48 小時(shí)。



通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)來(lái)確定細(xì)胞轉(zhuǎn)染的程度。 DYNAFECT-CD71 微珠促進(jìn) DNA 轉(zhuǎn)染到正常的 HL-60 細(xì)胞中，但當(dāng)細(xì)胞分化且不再表達(dá) CD71 時(shí)，這些微珠不再發(fā)生轉(zhuǎn)染。相反，將未分化的 HL-60 細(xì)胞與 DYNAFECT-CD11b 珠子混合不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞被 DNA 轉(zhuǎn)染，但當(dāng)細(xì)胞分化并開(kāi)始表達(dá) CD11b 時(shí)，這些磁珠確實(shí)會(huì)被轉(zhuǎn)染。

因此，免疫穿孔有可能靶向混合群體中特定類型的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，這取決于它們的免疫特性，并允許靶向細(xì)胞吸收各種不同的分子。這也發(fā)生在幾種哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中，這些細(xì)胞系具有一系列針對(duì)選定細(xì)胞表面抗原的不同抗體。正常情況下，細(xì)胞轉(zhuǎn)染水平為 40-80%，具體取決于混合條件，而無(wú)活力細(xì)胞的數(shù)量通常會(huì)少于20%。