生物反應(yīng)器助力江南大學(xué)采用生物法實現(xiàn)PCB藻藍(lán)素高水平合成

藻藍(lán)素（Phycocyanobilin，PCB）天然存在于藍(lán)藻光感應(yīng)系統(tǒng)中，在光能的吸收和傳遞中起著至關(guān)重要的作用，在光遺傳學(xué)的研究中被廣泛應(yīng)用。藻藍(lán)素具有亮麗的天藍(lán)色，可以作為天然色素，安全健康；也是FDA唯一批準(zhǔn)的藍(lán)色食品添加劑，營養(yǎng)豐富。PCB還具有抗氧化、消除自由基、修復(fù)細(xì)胞延緩衰老、保水抗凍的作用，廣泛應(yīng)用于化妝品領(lǐng)域。此外，作為一種安全的藥物，口服PCB在體內(nèi)可以轉(zhuǎn)化為NADPH氧化酶的有效抑制劑，在治療阿爾茨海默癥方面表現(xiàn)出巨大潛力；PCB對冠狀病毒主要蛋白酶的活性也具有潛在的抑制作用，有潛力應(yīng)用于新型冠狀肺炎病毒的防治。

目前，PCB的獲取方法主要采用高溫甲醇分解法從螺旋藻中提取。該方法存在諸多問題：(1) 甲醇高溫?zé)峤庑枰�耗費大量能量，造成能源浪費；(2) 螺旋藻中與PCB共存的其他色素，如葉綠素、葉黃素等一系列前體，對后期產(chǎn)物純化不利；(3) 螺旋藻生長周期較長，限制了藻藍(lán)素的生產(chǎn)效率和應(yīng)用。因此，從天然藻類中提取高純度的PCB是一項復(fù)雜且不經(jīng)濟的方法。

針對此問題，江南大學(xué)未來食品科學(xué)中心陳堅院士團隊趙鑫銳副研究員課題組采用生物法合成PCB，降低成本，節(jié)約能源，提高純度，在5-L發(fā)酵罐實現(xiàn)了PCB高水平合成。ACS Synthetic Biology在線發(fā)表了該研究成果“Efficient Synthesis of Phycocyanobilin by Combinatorial Metabolic Engineering in Escherichia coli”。
 
首先，經(jīng)過比較之后選擇了來源于T. elongatus的HO1和來源于Synechocystis sp的PcyA兩種酶來合成PCB。隨即確定含有強誘導(dǎo)啟動子（T7lac）的高拷貝數(shù)質(zhì)粒（pRSFDuet-1）更適合表達(dá)這兩種酶。
 
此外，在中等拷貝數(shù)的pCDFDuet-1載體中，采用DNA支架以2:1的比例實現(xiàn)HO和PcyA的有效組裝。
 
隨后，通過直接補充血紅素前體ALA和適度過表達(dá)血紅素生物合成途徑中的關(guān)鍵酶（HemB和HemH），增加細(xì)胞內(nèi)前體物質(zhì)供應(yīng)，促進PCB合成。由于催化血紅素合成PCB的兩步酶促反應(yīng)都伴隨著鐵氧還蛋白（Fd）和Fd-NADP+還原酶（Fnr）的循環(huán)再生，研究人員通過表達(dá)nadK基因（編碼 NAD+激酶）來加速輔因子循環(huán)，進一步增強了PCB合成。
 
此外，研究人員還通過添加還原劑作為輔助，發(fā)現(xiàn)當(dāng)培養(yǎng)基中加入維生素C或谷胱甘肽時，藻藍(lán)素產(chǎn)量會得到提高，進一步優(yōu)化了維生素C的添加量，發(fā)現(xiàn)添加5 g/L維生素C時，適合PCB生產(chǎn)。

分別在搖瓶和發(fā)酵罐水平對發(fā)酵條件進行優(yōu)化。在搖瓶水平，在30℃條件下用0.8 mM IPTG誘導(dǎo)，采用含有200 mg/L ALA、20 mg/L FeSO4·7H2O和5 g/L維生素C的MR培養(yǎng)基有利于提高PCB的產(chǎn)量。在5-L發(fā)酵罐水平（T&J Atype，迪必爾生物工程（上海）有限公司），采用pH-stat法進行補料分批發(fā)酵，添加600 g/L葡萄糖、8 g/L MgSO4·7H2O和200 mg/L FeSO4·7H2O。溫度控制在30°C，pH維持在7.0，通氣量2 L/min，攪拌速率200-800 rpm以保持30%的溶氧水平。
 
在發(fā)酵罐水平獲得藻藍(lán)素28.32 mg/L，打破至今報道的生產(chǎn)記錄。此研究為在大腸桿菌中合成藻藍(lán)素或血紅素衍生物及其他天然色素提供了策略。

參考文獻(xiàn)：
Zhao X, Gao H, Wang Y, Wang Z, Zhou J. Efficient Synthesis of Phycocyanobilin by Combinatorial Metabolic Engineering in Escherichia coli. ACS Synth Biol. 2022 Jun 17;11(6):2089-2097. doi: 10.1021/acssynbio.2c00016. Epub 2022 May 17. PMID: 35580338.
http://futurefoods.jiangnan.edu.cn/info/1072/1691.htm

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