CRISPR/Cas9介導(dǎo)可有效治療X-連鎖視網(wǎng)膜色素變性

色素性視網(wǎng)膜炎GTP酶調(diào)節(jié)因子(RPGR)基因的突變與X連鎖色素性視網(wǎng)膜炎(XLRP)相關(guān)，占所有色素性視網(wǎng)膜炎(RP)病例的10%至20%，是其最嚴重的形式之一。作者構(gòu)建RPGR突變的小鼠模型，經(jīng)過表型分析確認模型的代表性后，使用rAAV將CRISPR/Cas9修復(fù)系統(tǒng)遞送至病變模型鼠中，發(fā)現(xiàn)具有良好的治療效果。該研究發(fā)現(xiàn)了一種針對RPGR基因突變引起的XLRP的基因治療方式，為該類患者帶來治愈的希望。

 

一、研究思路

❖構(gòu)建RPGR-KO小鼠模型，發(fā)現(xiàn)光感受細胞退化與光感受蛋白表達異常。

❖采用CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯治療方案，能有效治療光感受細胞退化等癥狀。

 

二、RPGR-KO小鼠模型的建立

作者設(shè)計了兩個靶向RPGR基因外顯子8的sgRNA（圖1A）。然后將體外轉(zhuǎn)錄的Cas9的mRNA和sgRNA注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中構(gòu)建RPGR-KO小鼠模型。并且通過Sanger測序分析，確定該模型構(gòu)建成功（圖1B）。

 

作者選擇在外顯子8（圖1C）中具有5bp缺失（c.974_978delAAATT；p.K325Nfs*1）的小鼠進行下一項研究。在WT小鼠上分析RPGR的表達和定位，其顯示出桿狀免疫反應(yīng)性，在連接纖毛處具有更亮的小斑點。而在RPGR-KO視網(wǎng)膜中未檢測到RPGR染色（圖1D）。因此5-bp缺失導(dǎo)致RPGR失活。

圖1 RPGR-KO小鼠模型的構(gòu)建與鑒定

 

三、RPGR-KO小鼠模型的病變表型

作者接著對5bp缺失小鼠模型進行了仔細的表型分析。通過對WT和RPGR-KO小鼠進行視網(wǎng)膜眼底成像（圖2A），發(fā)現(xiàn)RPGR-KO小鼠在3個月大時視網(wǎng)膜眼底的所有象限都出現(xiàn)了多個均勻分布的小黃白色斑點。并且伴隨感光器退化，這些斑點變得更大和匯合。到12個月大時，這些斑點變得稀疏，但色素沉積明顯。

 

經(jīng)過組織學(xué)評估WT和RPGR-KO小鼠的視網(wǎng)膜切片，在6個月大時，外核層（outer nuclear layer, ONL）中的感光細胞有輕微的衰老相關(guān)損失。到12個月大時，RPGR-KO小鼠的感光細胞損失變得明顯（圖2B）。

 

作者測量ONL厚度，發(fā)現(xiàn)WT和突變小鼠之間的ONL厚度存在顯著差異（圖2C）。伴隨形態(tài)學(xué)變性，視網(wǎng)膜電圖（Electroretinogram, ERG）測量的視網(wǎng)膜功能也表現(xiàn)出異常。

 

通過ERG發(fā)現(xiàn)在3個月時，RPGR-KO小鼠中暗適應(yīng)的ERG與WT小鼠沒有顯著差異，但b波振幅降低（圖2D）。而在6個月時，ERG幅度（包括a波和b波幅度）進一步降低，在12個月大時幾乎沒有可記錄的ERG a波和b波反應(yīng)（圖2E）。

 

圖2 RPGR-KO小鼠視網(wǎng)膜的形態(tài)變化

 

在6個月大的RPGR-KO小鼠中，檢測到視紫紅質(zhì)、M-視蛋白和S-視蛋白表達顯著下降，僅可見稀疏的PNA染色，這與外段完整性和蛋白質(zhì)穩(wěn)定性下降一致。在12個月大的RPGR-KO小鼠中，PNA和S-視蛋白染色進一步減少，僅觀察到偶爾的視紫紅質(zhì)和M-視蛋白表達（圖3）。

 

RPGR-KO小鼠的視網(wǎng)膜形態(tài)和功能顯示出緩慢但漸進的年齡相關(guān)性視網(wǎng)膜變性。顯著的退行性變化開始于6個月大，這表明該模型可以模擬人類發(fā)生的進行性視網(wǎng)膜退行病變。因此，這種RPGR-KO小鼠模型為基因編輯治療研究提供了一個極好的動物模型系統(tǒng)。

圖3 RPGR-KO小鼠的感光細胞退化

 

四、通過AAV-CRISPR/Cas9可有效治療RPGR突變引起的視網(wǎng)膜退行性病變

通過兩個單獨的AAV2/8載體將靶向突變RPGR基因座的sgRNA表達盒和修復(fù)供體模板傳遞給6個月大的RPGR^-/yCas9^+/WT小鼠（圖4A-D）。

圖4 治療策略

治療后6個月，與同一只眼睛視網(wǎng)膜未治療區(qū)域相比，治療區(qū)域中觀察視網(wǎng)膜感光細胞的層數(shù)明顯增加（未治療區(qū)域感光細胞層數(shù)：4層，且排列松散；治療區(qū)域感光細胞層數(shù)：9層）（圖5A、5B）。治療區(qū)域的ONL明顯比未治療區(qū)厚。治療區(qū)域中感光細胞的密度為316個核/100µm，比未治療區(qū)域（128個核/100µm；圖5C）高1.5倍。通過免疫熒光分析，發(fā)現(xiàn)RPGR、PNA和M-視蛋白的表達得到恢復(fù)（圖5D）。

圖5 治療6個月后病變小鼠的視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)得到恢復(fù)

在治療后12個月評估了視網(wǎng)膜形態(tài)，RPGR和PNA染色跨越了大約四分之三的橫截面（圖6A、6B）。治療區(qū)感光細胞的密度為261個核/100µm，是未治療區(qū)域（87個核/100µm；圖6C）的三倍。這些數(shù)據(jù)表明，CRISPR/Cas9介導(dǎo)的RPGR基因編輯療法可以防止光感受器退化，并且這種療法持續(xù)了很長時間。

圖6 12個月后病變小鼠的視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)

得到更有效的治療效果

五、結(jié)語

該文獻研究思路清晰，首先構(gòu)建了具有代表性的進行性視網(wǎng)膜退行病變小鼠模型，然后再使用AAV將CRISPR/Cas9修復(fù)系統(tǒng)遞送至眼部進行有效治療�？梢钥闯�，眼科疾病治療靶點的發(fā)現(xiàn)需要有效的疾病模型�，F(xiàn)今通常采用小鼠作為構(gòu)建疾病模型的對象，這是由于成本較低和構(gòu)建體系成熟等因素決定的。而治療方式的開發(fā)，則一般采用AAV遞送基因片段進行治療�，F(xiàn)今雖然常用回補有效基因片段的策略，但針對基因SNP突變等情況的CRISPR/Cas9修復(fù)策略也再不斷地被研究開發(fā)。

 

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Hu S, Du J, Chen N, et al. In Vivo CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing Mitigates Photoreceptor Degeneration in a Mouse Model of X-Linked Retinitis Pigmentosa. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2020;61(4):31.