監(jiān)測(cè)實(shí)時(shí)分析在Cell首次揭秘溶酶體氫離子通道的應(yīng)用

北京時(shí)間2022年6月23日晚23時(shí)，在發(fā)表于Cell雜志的一項(xiàng)研究中，美國(guó)密歇根大學(xué)安娜堡分校徐浩新（Haoxing Xu）團(tuán)隊(duì)鑒定出首個(gè)溶酶體膜上的氫離子通道TMEM175，并發(fā)現(xiàn)TMEM175在調(diào)控溶酶體酸堿平衡的重要作用——處于激活狀態(tài)的TMEM175能夠介導(dǎo)過(guò)量的氫離子溢出溶酶體，從而避免溶酶體內(nèi)部處于過(guò)酸性狀態(tài)。

 

徐浩新教授和胡美欽博士為論文共同通訊作者，胡美欽博士、李平博士和王策博士為共同第一作者
 

作為細(xì)胞中的“回收站”，溶酶體在細(xì)胞健康代謝中發(fā)揮著重要作用。而溶酶體內(nèi)部偏酸性的pH環(huán)境（pH~4.6），又是保障溶酶體持續(xù)正常運(yùn)轉(zhuǎn)的基礎(chǔ)。那么溶酶體內(nèi)部pH的穩(wěn)態(tài)究竟是如何維持的呢？質(zhì)子泵V-ATPase自然居功至偉。此前，V-ATPase復(fù)合物已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)可以通過(guò)一系列精妙的調(diào)節(jié)機(jī)制，實(shí)現(xiàn)對(duì)溶酶體內(nèi)外pH穩(wěn)態(tài)的維持。這套復(fù)雜的分子機(jī)器能夠利用ATP水解產(chǎn)生的能量，源源不斷地將細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中的氫離子逆濃度梯度泵入溶酶體內(nèi)部，從而為溶酶體營(yíng)造出一片酸性的環(huán)境。除此之外，研究者們一直認(rèn)為存在未被鑒定的氫離子通道來(lái)介導(dǎo)氫離子快速外流，并和V-ATPase協(xié)同來(lái)調(diào)節(jié)溶酶體的酸堿平衡。
 

這一研究的靈感來(lái)源于徐浩新教授團(tuán)隊(duì)很早以前的一個(gè)發(fā)現(xiàn)：他們?cè)趯?duì)細(xì)胞內(nèi)溶酶體膜直接進(jìn)行電生理記錄時(shí)，只要溶酶體膜內(nèi)外仿照生理?xiàng)l件存在pH差別（膜外為pH=7.2的中性環(huán)境，膜內(nèi)為pH=4.6的酸性環(huán)境），就總是能夠記錄到特異的從膜內(nèi)流向膜外的微弱電流。假如將膜內(nèi)pH調(diào)整為更加酸性的3.5，這一信號(hào)會(huì)更加強(qiáng)烈�；�于這一觀(guān)測(cè)，作者大膽猜測(cè)介導(dǎo)該電流的離子通道即是科學(xué)家們苦苦追尋的溶酶體膜上的氫離子通道，與V-ATPase質(zhì)子泵互相配合，一進(jìn)一出，共同調(diào)節(jié)溶酶體的pH平衡。
 

為了找出這一“預(yù)測(cè)存在”的溶酶體氫離子通道蛋白，作者對(duì)一系列可能的溶酶體膜蛋白逐一進(jìn)行過(guò)表達(dá)測(cè)試，最終，在排除了數(shù)十個(gè)蛋白后，發(fā)現(xiàn)當(dāng)膜蛋白TMEM175被過(guò)量表達(dá)時(shí)，所記錄到的“氫離子電流”竟比對(duì)照組高出了20倍之多；與此同時(shí)，利用CRISPR-Cas9技術(shù)將TMEM175基因進(jìn)行敲除后，即使設(shè)定溶酶體膜內(nèi)pH為更酸的 3.5的情況下也記錄不到任何電流信號(hào)。這些結(jié)果表明，TMEM175就是那個(gè)介導(dǎo)氫離子進(jìn)出溶酶體的離子通道。可經(jīng)過(guò)查閱文獻(xiàn)卻發(fā)現(xiàn)，此前圍繞TMEM175的研究工作普遍認(rèn)為這是一個(gè)鉀離子通道。那么問(wèn)題來(lái)了，該如何解釋兩者之間的差異呢？
 

經(jīng)過(guò)對(duì)比，他們注意到兩者所采用的實(shí)驗(yàn)條件卻存在著一個(gè)本質(zhì)的不同：先前文獻(xiàn)在研究TMEM175時(shí)，忽略了pH對(duì)通道功能的調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而認(rèn)為T(mén)MEM175主要通透的是鉀離子；而胡美欽等人則是在將溶酶體內(nèi)部pH調(diào)節(jié)為更接近生理環(huán)境的酸性的條件下開(kāi)展的一系列實(shí)驗(yàn)——他們確認(rèn)：在此生理酸性條件下，通過(guò)TMEM175的離子主要為氫離子，而非鉀離子，經(jīng)過(guò)定量計(jì)算，得出TMEM175對(duì)氫離子的通透性是鉀離子的約五萬(wàn)倍。
 

更加令人振奮的是，他們還首次鑒定出可以激活TMEM175通道的小分子化合物DCPIB和ML 67-33。這些化合物不僅能激活通道的氫離子電流，在中性條件下也同樣可以激活鉀離子電流。此外他們還發(fā)現(xiàn)內(nèi)源的脂質(zhì)分子花生四烯酸（Arachidonic Acid, ArA）是TMEM175通道內(nèi)源的激活劑，提示脂質(zhì)信號(hào)通路很可能對(duì)TMEM175的活性存在調(diào)節(jié)作用。這些激動(dòng)劑均可以特異性的激活TMEM175通道來(lái)釋放溶酶體內(nèi)的氫離子（溶酶體內(nèi)pH上升），所以TMEM175成為可以用來(lái)調(diào)節(jié)溶酶體酸堿度的新靶點(diǎn)

 

為了進(jìn)一步探究離子通道TMEM175的調(diào)控機(jī)制，作者將溶酶體內(nèi)部調(diào)整為中性pH、將溶酶體外部調(diào)整為酸性pH，發(fā)現(xiàn)此時(shí)即使空有氫離子濃度梯度，卻無(wú)法記錄到氫離子電流，表明溶酶體內(nèi)部的氫離子對(duì)于TMEM175激活必要性，即TMEM175可以被氫離子本身激活。
 

雖然在過(guò)表達(dá)的情況下可以在部分細(xì)胞上記錄到TMEM175鉀電流，但是內(nèi)源性的TMEM175卻沒(méi)有表現(xiàn)出可被記錄到的鉀電流，而激動(dòng)劑DCPIB和花生四烯酸卻可以激活出明顯的鉀電流，所以TMEM175并不是如之前所認(rèn)為的自然開(kāi)放的鉀離子通道，而是一種新型的具備門(mén)控機(jī)制的氫離子通道，并在中性或堿性環(huán)境以及激動(dòng)劑存在的條件下具備鉀離子通透能力
 

通過(guò)突變篩選，當(dāng)TMEM175蛋白中第41個(gè)氨基酸由帶負(fù)電的的天冬氨酸突變?yōu)橹行缘谋�氨酸（記為D41A突變體）時(shí)，TMEM175完全失去了酸性條件下通透氫離子的能力，但中性條件下通透鉀離子的能力得到了保留。利用D41A突變體，可以得出結(jié)論：TMEM175的氫離子的通透性，而不是鉀離子的通透性，是調(diào)控溶酶體pH相關(guān)功能的關(guān)鍵所在。
 

近年來(lái)，研究者在帕金森綜合征的病人體內(nèi)普遍檢測(cè)到了TMEM175基因的突變，能進(jìn)一步探索TMEM175功能更為廣闊的生理學(xué)意義。
 

首先，在細(xì)胞水平，TMEM175基因敲除細(xì)胞內(nèi)溶酶體的pH穩(wěn)態(tài)被破壞，溶酶體處于一種“酸性過(guò)強(qiáng)”的狀態(tài)，同時(shí)溶酶體內(nèi)部的蛋白水解酶Cathepsin B和Cathepsin D活性受到影響。其次，動(dòng)物模型中，研究者構(gòu)建了TMEM175基因敲除小鼠，在小鼠神經(jīng)元中同樣觀(guān)察到了溶酶體酸性過(guò)強(qiáng)、溶酶體降解功能受損的現(xiàn)象。同時(shí)，與神經(jīng)退行性疾病帕金森癥致病相關(guān)的α-Synuclein聚積現(xiàn)象在TMEM175基因敲除小鼠中也更為顯著。

 

綜上所述，本項(xiàng)研究開(kāi)辟了溶酶體pH調(diào)節(jié)的新方向，首次鑒定出溶酶體膜上的氫離子通道：TMEM175是一種新型的氫離子激活的氫離子通道。未來(lái)，我們期待更多圍繞TMEM175調(diào)節(jié)機(jī)制的精彩工作，以及TMEM175在神經(jīng)退行性模型中所扮演的角色！

活體化學(xué)物質(zhì)實(shí)時(shí)檢測(cè)系統(tǒng)可在動(dòng)物清醒狀態(tài)下實(shí)施監(jiān)測(cè)多巴胺，抗壞血酸，鉀離子，腎上腺素，硫化氫，鈣離子，過(guò)氧化氫，氧氣，PH值，鎂離子，葡萄糖，乳酸等化學(xué)物質(zhì)。
 

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