直播回顧：平鋪光片顯微鏡及組織透明化技術(shù)應(yīng)用

 

2022年7月8日, 锘海線上直播圍繞LS18平鋪光片顯微鏡技術(shù)、生物組織透明化技術(shù)、測樣服務(wù)平臺(tái)以及LS18平鋪光片顯微鏡應(yīng)用案例等主題進(jìn)行報(bào)告和展示。
 

在報(bào)告互動(dòng)環(huán)節(jié)中，各位老師就目前課題方向提出諸多代表性疑問，讓我們一起回顧下精彩問答。
​

Q: 什么是平鋪光片技術(shù)？以及該技術(shù)的控制的原理是怎樣的？

A：平鋪光片技術(shù)是一種新型的選擇性平面照明顯微鏡（SPIM）三維成像技術(shù)，在不增加光片厚度、不降低激發(fā)光片約束能力的情況下，增加SPIM的FOV。如圖1所示，在探測焦平面內(nèi)沿光片長軸方向(y方向)平鋪小而薄的光片，在每個(gè)位置拍攝一幅圖像，將所有圖像組合并重建整個(gè)FOV的圖像。 

平鋪光片技術(shù)的控制原理：

在成像時(shí)，無論是通過移動(dòng)物鏡或是移動(dòng)樣本等物理方式，都會(huì)影響成像質(zhì)量，造成artifacts。LS18光片顯微鏡創(chuàng)新地采用平鋪光片模式，通過對空間光調(diào)制器加載不同的相位圖以對激發(fā)光束進(jìn)行調(diào)制，實(shí)現(xiàn)快速平鋪短而薄的光片，擴(kuò)大了FOV且不影響空間分辨率和光學(xué)層析能力，從而獲得均一的高分辨率3D圖像�？臻g光調(diào)制器對激發(fā)光相位進(jìn)行調(diào)制幾乎可以解決所有的光片校準(zhǔn)問題，真正地實(shí)現(xiàn)顯微鏡儀器的自動(dòng)校準(zhǔn)，并且性能非常穩(wěn)定，易于操作和維護(hù)。另外，根據(jù)不同樣品的研究需求，LS18光片顯微鏡能夠靈活地調(diào)整光片平鋪次數(shù)以及成像速度，實(shí)現(xiàn)不同類型的完整組織器官的3D結(jié)構(gòu)與功能測量。

 

圖1. TLS-SPIM的工作原理，（左）通過快速平鋪小而薄的光片，（右）在每個(gè)位置拍攝一幅圖像，將所有圖像組合重建整個(gè)FOV的圖像，使得視野范圍內(nèi)各處成像分辨率均一。

關(guān)于平鋪光片技術(shù)的詳細(xì)原理可參考以下文獻(xiàn)：

1. Gao, Liang. Extend the field of view of selective plan illumination microscopy by tiling the excitation light sheet[J]. Optics Express, 2015, 23(5):6102-11.

2. Fu Q , Martin B L , Matus D Q , et al. Imaging multicellular specimens with real-time optimized tiling light-sheet selective plane illumination microscopy[J]. Nature Communications, 2016, 7:11088.
 

Q: 用lectin標(biāo)記血管時(shí)，是尾靜脈注射后再取器官然后透明化，還是先透明化再用染色儀器將lectin標(biāo)記上?
A: 血管標(biāo)記透明化和染色順序問題，在實(shí)驗(yàn)案例當(dāng)中，兩種方式我們都有嘗試過，實(shí)際上它都是可行的。首先，lectin的尾靜脈注射方式對整個(gè)灌注流程來說，需要非常大的技術(shù)把控性。如何做到良好的靜脈內(nèi)注射并維持小鼠一定時(shí)間的存活率，對于實(shí)驗(yàn)室新手可能需要多加練習(xí)。由于lectin具有半衰期，可參考發(fā)表文獻(xiàn)中的操作步驟，根據(jù)代謝動(dòng)力學(xué)來選擇一個(gè)合適的時(shí)間，需要注意的是在灌注流程過程當(dāng)中剝離取材時(shí)間或者說lectin的孵育時(shí)間。同時(shí)，有些客戶送到我們這邊的樣本可能在前期經(jīng)過灌注后會(huì)產(chǎn)生熒光淬滅的問題，我們可以選擇性幫老師做鞏固結(jié)構(gòu)及加強(qiáng)染色步驟。對于加強(qiáng)染色這部分，可用lifecanvas 的SmartBatch+主動(dòng)式透明化/染色一體電泳儀，亦可采用傳統(tǒng)的被動(dòng)滲透式方法來實(shí)現(xiàn)。
 

Q: 請問哪種透明方法和免疫染色結(jié)合的比較好?
A: 透明化方法和免疫染色的結(jié)合目前為止沒有好壞之分，大組織樣品免疫染色目前是世界性的難題，從目前眾多老師和我們測樣的經(jīng)驗(yàn)來看，油性染色方法中idisico和Pegasos的方法都比較可行，但是idisco涉及甲醇的脫水步驟，所以對抗體和甲醇的兼容性要求比較高，有條件的用戶我們建議可以先做個(gè)兼容性測試，這樣有助于提升后期染色的效率。

通常來說，熒光基團(tuán)在水性的環(huán)境當(dāng)中保存性也更好。所以，如果樣品可以滿足水性透明化方法的前提下，可以盡量嘗試采用水性透明化方法，同時(shí)關(guān)注指標(biāo)染色特異性及有效性。

此外，大組織免疫染色還與樣品大小有關(guān)。在不同組織中，如：對于腸道、肺、整腦、整個(gè)腦連脊髓、心臟等各類樣品，方法和步驟都有區(qū)別。所以透明化方法一定要和免疫染色指標(biāo)綜合考慮，才能尋找”更優(yōu)解“，跟我們目前有限的經(jīng)驗(yàn)，需要根據(jù)樣品和染色指標(biāo)來進(jìn)行綜合篩選，尋找合適的組合。
 

Q: matrigel細(xì)胞外基質(zhì)膠可以通過哪幾種透明化方法處理？
A：涉及matrigel細(xì)胞外基質(zhì)的樣品一般多是類器官樣品，此類樣品可以通過多種方法透明進(jìn)行透明化和染色。因?yàn)檫@類樣品相對whole tissue來說一般體積較小，所以這個(gè)情況下，實(shí)際上有多種透明化方法可嘗試，甚至可以結(jié)合我們更新的膨脹技術(shù)達(dá)到納米級(jí)別的分辨，在3D納米級(jí)水平完整展示整個(gè)類器官樣品形貌。為方便廣大科研老師，我們锘海依托大量實(shí)驗(yàn)案例開發(fā)出的組織透明化試劑盒（#NH-210701）就可以應(yīng)用于類器官的透明化，試劑盒附有詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟可供老師選擇。
 

Q: 采集的圖像信息量很大，如何進(jìn)行數(shù)據(jù)處理？大量的光學(xué)切片需要拼接，軟件怎么選擇？另外，用什么軟件實(shí)現(xiàn)細(xì)胞分割和單細(xì)胞追蹤？定量分析可以采用第三方軟件嗎？圖像輸出是什么格式？

A：平鋪光片顯微鏡采集的大樣本成像數(shù)據(jù)量能達(dá)到幾百GB或TB級(jí)別，可通過锘海自主研發(fā)的數(shù)據(jù)預(yù)處理軟件對采集圖像預(yù)處理，輸出.3dtiff格式的原始數(shù)據(jù)供第三方數(shù)據(jù)分析軟件調(diào)用（如圖2所示）。通過第三方軟件或自主拼接軟件即可實(shí)現(xiàn)將所有ROI數(shù)據(jù)都拼接在一起，得到一個(gè)完整樣品的3D數(shù)據(jù)（如下圖所示）。

圖2. 平鋪光片經(jīng)數(shù)據(jù)提取后得到全視野高分辨率的圖像

目前能實(shí)現(xiàn)3D大圖拼接的第三方軟件有很多，如Amira、Imaris，均可以對.3dtiff格式原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，可實(shí)現(xiàn)常規(guī)的單個(gè)區(qū)域數(shù)據(jù)結(jié)果快速查看、單個(gè)區(qū)域數(shù)據(jù)動(dòng)態(tài)展示、大樣本數(shù)據(jù)整體拼接、大樣本組織整體圖像處理及展示等操作。另外，3D成像的數(shù)據(jù)處理對電腦性能配置也有一定的需求，一般推薦128GB以上內(nèi)存，4T以上的SSD，并需配備較高性能獨(dú)立顯卡。

上述這些第三方的專業(yè)圖像處理軟件均有相應(yīng)的圖像分析模塊，可實(shí)現(xiàn)分割、單細(xì)胞追蹤及定量分析等功能。
 

Q: 組織透明化對組織本身有化學(xué)損傷嗎？會(huì)破壞組織內(nèi)熒光物質(zhì)（如GFP）嗎？

A: 組織透明化方法分為主動(dòng)式透明化方法和被動(dòng)式透明化方法兩個(gè)大類，以引入外力或生化試劑的被動(dòng)擴(kuò)散來完成對組織的透明化，組織透明化技術(shù)保留了組織的細(xì)胞間連接和細(xì)微特征。不同的組織透明化方法因其機(jī)理不同，對組織的形態(tài)、透明程度、透明效率、脂質(zhì)留存、內(nèi)源性熒光信號(hào)、核酸物質(zhì)、免疫染色等的影響不盡相同。例如被動(dòng)式透明化方法中的有機(jī)溶劑透明化方法，通過先脫去組織的水分，再利用高折射率的有機(jī)溶液進(jìn)行折射率匹配，雖然達(dá)到很好的透明效果，但是對于熒光蛋白的信號(hào)產(chǎn)生淬滅作用。熒光蛋白中的親水基團(tuán)使得親水溶劑透明化方法更有利于熒光的保存。被動(dòng)式的親水溶劑透明化方法通過浸泡將低折射率的組織液、細(xì)胞液或是高折射率的脂質(zhì)逐漸替換，實(shí)現(xiàn)折射率一致，這類方法雖然更利于熒光保存，但耗時(shí)較長�；�于CLARITY/SHIELD技術(shù)的主動(dòng)式透明化方法從保護(hù)熒光蛋白構(gòu)象出發(fā)，不僅能留存內(nèi)源性蛋白、核酸，還通過電泳加速移除脂質(zhì)，使透明化的效率提高。

 

參考文獻(xiàn)：

馮異. 醫(yī)學(xué)組織透明化三維成像 [M]. 復(fù)旦大學(xué)出版社，2020：3-21.

Chung et al., Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature, 2013.

Park et al., Protection of tissue physicochemical properties using polyfunctional crosslinkers. Nature Biotechnology, 2019. 
直播回放視頻鏈接：https://v.qq.com/x/page/g3347h98jn8.html?sf=uri

锘海LS18平鋪光片顯微鏡

專為透明化樣品設(shè)計(jì)的高速高分辨三維熒光顯微鏡成像系統(tǒng)

針對透明化樣品的3D熒光成像，采用與西湖大學(xué)高亮（平鋪光片技術(shù)發(fā)明人）實(shí)驗(yàn)室共同研制的光片顯微鏡Nuohai LS 18，其運(yùn)用創(chuàng)新的平鋪光片技術(shù)，克服了傳統(tǒng)光片顯微鏡中空間分辨率、光學(xué)層析能力和成像視野大小之間的矛盾，從而獲得均勻高分辨率的3D熒光圖像，廣泛應(yīng)用于腦科學(xué)、腫瘤學(xué)、藥物研發(fā)、干細(xì)胞研究、組織胚胎學(xué)、組織病理診斷等各個(gè)領(lǐng)域。

锘海LS18平鋪光片顯微鏡，詳細(xì)信息請點(diǎn)擊鏈接：锘海LS18平鋪光片顯微鏡

锘海組織透明化試劑盒  Cat#：NH210701

锘海自主研發(fā)的組織透明化試劑盒依托測樣服務(wù)中積累到的豐富而寶貴的經(jīng)驗(yàn)，對各種透明化方法進(jìn)行測試和比較后對試劑配方進(jìn)行了精心優(yōu)化，使其在組織熒光保護(hù)、樣本形態(tài)維持、降低自發(fā)熒光等方面表現(xiàn)出非常優(yōu)異的性能。能夠輕松實(shí)現(xiàn)小鼠腦、心、肝、脾、肺、腎、胃、腸、睪丸、淋巴、胎盤、卵巢等各類組織器官的透明化，適用范圍廣、操作簡便、速度快、效率高，是廣大科研工作者的不二之選。

锘海組織透明化試劑盒，詳細(xì)信息請點(diǎn)擊鏈接：锘海組織透明化試劑盒

锘海一站式科研服務(wù)   讓科研變得更簡單

組織透明化技術(shù)和光片熒光顯微技術(shù)的發(fā)展，使研究者能從宏觀到微觀對生物組織內(nèi)部的結(jié)構(gòu)及生理、病理特征進(jìn)行觀察和功能性分析。锘海生物科學(xué)儀器（上海）有限公司提供完整器官的組織透明化、組織免疫熒光染色、高分辨3D顯微成像以及大數(shù)據(jù)分析一體化服務(wù)，旨在通過準(zhǔn)確、快速、多樣化的一站式科研服務(wù)為每一位生命科學(xué)工作者提供個(gè)體化/定制化的解決方案。

锘海一站式科研服務(wù)，詳細(xì)信息請點(diǎn)擊鏈接：锘海一站式科研服務(wù)

聯(lián)系我們:
電話：021-37827858、13818273779（微信同號(hào)）
郵箱：info@nuohailifescience.com
地址：上海市松江區(qū)順慶路650號(hào)1幢102、202室