活細胞成像在細胞培養(yǎng)中的應用

1. 什么是活細胞成像

活細胞成像是研究動態(tài)細胞生長過程和影響變化最有力的方法，已廣泛應用于許多不同領域。細胞在機體中是動態(tài)變化的，對于其生長過程與外界控制變量對其影響的結果的觀察研究，需要應用活細胞成像技術，實時記錄細胞生長狀態(tài)及表達活動等，還可根據研究的需要，對細胞進行熒光標記處理，以研究包括胚胎發(fā)育、細胞骨架變化、細胞分裂等動態(tài)活動。
 

活細胞常用熒光觀察
 

2. 細胞培養(yǎng)的應用

（1）劃痕實驗，也稱創(chuàng)傷愈合實驗，模擬了細胞在體內愈合過程中的遷移過程�；�本步驟包括在細胞單層中創(chuàng)建一個“傷口”，在細胞遷移過程中在開始和定期捕獲圖像至傷口關閉，通過活細胞成像較長時間的拍攝，使用過程圖像分析以確定細胞遷移速率。
（2）細胞匯合度檢測，定義為平面培養(yǎng)物被細胞覆蓋的表面積的百分比。通常，匯合度用于評估何時需要傳代細胞，及時地把握時間對維持細胞表型和培養(yǎng)質量至關重要。
 

相襯觀察活細胞是細胞培養(yǎng)的日常

（3）細胞培養(yǎng)監(jiān)測，使用培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、多孔板、細胞工廠等容器承載活細胞時，根據觀測的培養(yǎng)細胞規(guī)模、監(jiān)測目的、監(jiān)測環(huán)境，來選擇合適的活細胞成像設備。

（4）轉染監(jiān)測，通過使用帶有熒光觀察功能的倒置顯微鏡和活細胞成像儀，可直接可視化和監(jiān)測轉染細胞對外源元素的吸收和表達，還可根據實驗轉染熒光種類的需求，選擇單通道或多通道對一種或多種熒光信號進行監(jiān)測。
 

3. 細胞培養(yǎng)成像難點

細胞活動是一個動態(tài)持續(xù)的過程，細胞本身也是比較脆弱的，對活細胞成像時應關注光毒性、添加物毒性等對細胞健康的影響，需要在持續(xù)高質量成像與細胞健康之間保持較好的平衡。有以下幾個難點需要注意：

• 細胞的長時間活性和健康度需要培養(yǎng)條件支持。細胞的活性和健康度需要合適的溫度、濕度和氣體培養(yǎng)條件支持，離開了這些條件細胞無法長時間保持活性。如果觀察和實驗可以短時間完成，那么離開培養(yǎng)條件后盡快完成觀察和實驗即可。對于需要長時間觀察的細胞活動，則需要考慮把成像設備放到培養(yǎng)箱里，或者把培養(yǎng)皿放到成像設備上然后使用微流控細胞芯片分析儀等調節(jié)、保持培養(yǎng)條件。

• 不合適的光源可能損傷細胞活性和健康度。高能量的激發(fā)光（如汞燈的紫外線）、高強度的光照（如共聚焦的激光光源）、長時間照射，會影響細胞的活率和健康度，這在傳統(tǒng)汞燈光源中比較明顯。使用LED冷光源的寬場熒光顯微鏡，做無需染色的相襯或者霍夫曼調制相襯觀察，是光源性損傷更低的方案，需要熒光染色時使用低光毒性的的長波段熒光染料（如cy5、cy5.5、cy7等），搭配盡可能低的光強和盡可能短的激發(fā)/成像時間，也是一種思路。

• 熒光染料可能損傷細胞健康。熒光染料的毒性和激發(fā)光的光毒性會使細胞健康處于不良的狀態(tài)，典型的是DAPI和Hoechst，這些染料有一定的毒性，并且使用有光毒性的紫外光激發(fā)，對于這種情況，建議在染色后盡快實驗，并盡量縮短實驗時間。

• 不合適的熒光染料搭配會導致成像不理想。熒光染料不合適或過多，會導致光譜重疊、非特異性染色，背景信號會增強，影響熒光成像效果。為了避免這種問題，需要合理選擇染料的種類和數量，盡量錯開發(fā)射波段，并針對染料選擇合適的濾光片，通常使用窄帶發(fā)射濾光片會有更好的效果。另外還可通過加入適量試劑減少背景熒光。

• 熒光成像考驗相機的靈敏度。熒光成像屬于弱光成像，普通顯微鏡相機可能會出現成像時間長、背景噪聲高的問題，拍攝的圖片容易糊掉。使用高靈敏度的相機，可以降低成像時間，減少光毒性影響，并減少背景噪聲，這對于紫外成像和紅外成像來說更加明顯。對于650nm以上的紅外波段成像，還需要用到去除了藍玻璃/IRCF的sCMOS科研級相機（黑白）。

• 焦面漂移，觀察目標可能會在實驗過程中因移動而失焦。具有自動聚焦功能的活細胞成像儀，可以幫助您保持更長的目標聚焦時間并減少焦點漂移。另外，將細胞培養(yǎng)在恒定溫度并保持容器中溶液的體積恒定也有助于解決聚焦漂移問題

4. 細胞培養(yǎng)解決方案推薦

(1) 典型解決方案：倒置熒光顯微鏡MF52-N + 高靈敏度顯微鏡相機MC50-S/MS23

• 倒置熒光顯微鏡，可實現相差觀察、熒光觀察和明場觀察

• LED冷光源，紫外波段單獨控制，光毒性更低

• 可個性化選擇熒光通道，實現多種熒光信號觀測

• 可選高靈敏度相機，弱熒光信號捕獲能力強，成像效果優(yōu)異

(2) 局促空間解決方案：活細胞成像儀（自帶無線相機）

• 高度一體化，支持相襯和明場觀察成像

• LED冷光源，紫外波段單獨控制，光毒性更低

• 尺寸小巧輕便，可用于空間狹小細胞房

• 可用電腦平板無線連接相機，避免線材造成不便

• 可選配自動對焦、熒光、雙物鏡等升級配置

(3)研究級解決方案：電動XYZ倒置熒光顯微鏡MF53-N + 高靈敏相機MC50-S/MS23 或 研究級相機MSH12/MSH05

• 研究級倒置熒光顯微鏡，高質量相襯、熒光和明場成像，另有霍夫曼版本

• 觸屏控制LED冷光源，紫外波段單獨控制，光毒性更低

• 濾光片組可自主選擇替換，實現不同熒光染色觀察需求，如Fura-2鈣離子探針

• 三軸高精度電動平臺，重復定位精度1μm，可精確定位和自動對焦

• 選配高靈敏度相機滿足熒光成像，選配研究級相機滿足特殊成像要求，如Cy7染料

(4)原有產品升級方案：四大各品牌顯微鏡 + LED熒光光源/模塊 + 高靈敏顯微鏡相機MC50-S/MS23

• 寬光譜大功率LED熒光光源MG-100和四通道光源MG-120可適配四大各品牌主流熒光顯微鏡，使用更方便，壽命更長，紫外光毒性更低

• 奧林巴斯CKX41/CKX53，尼康TS100、徠卡DMIL等倒置顯微鏡都可以用我們的模塊升級為熒光顯微鏡，高性價比實現熒光觀察功能

• 高靈敏度相機搭配定制接口，可適配四大各品牌主流倒置顯微鏡和倒置熒光顯微鏡

明美是一家專注顯微成像產品研發(fā)與銷售的高新技術企業(yè)，是中國儀器儀表行業(yè)協會光學分會理事單位，醫(yī)療器械顯微鏡生產及經營廠家。
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