層流剪切應力通過其敏感軸調(diào)控減輕單核細胞粘附和動脈粥樣硬化的發(fā)展

根據(jù)血流形態(tài)和位置的不同，流體剪切應力有不同的表現(xiàn)形式。例如，當血液在血管的直線部分流動時，會產(chǎn)生層流剪切應力（Lss），但當血液流過血管分支、分叉或彎曲時，會產(chǎn)生振蕩剪切應力或湍流。大量研究證實，動脈粥樣硬化（AS）在直血管中的發(fā)生率較低，而血管分叉處和彎曲處的動脈粥樣硬化發(fā)生率較高。因此，Lss 具有重要的抗 AS 作用。

CX3CL1 是由 373 個氨基酸組成的大分子蛋白，是目前已知的 CX3C 趨化因子家族中唯一已知的成員。研究報道，低剪切應力通過激活 CX3CL1 誘導單核細胞與 TNF-α（也稱為 TNF）激活的人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）的粘附，而生理剪切應力消除了這種內(nèi)皮炎癥。通過分析高通量測序數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn) CX3CL1 在 Lss 處理的內(nèi)皮細胞中表達水平較低。因此，進一步的研究需要揭示 Lss 通過降低 CX3CL1 表達來抑制 AS 進展。

MicroRNAs（miRNAs）是一種長度約為 22 個核苷酸的非編碼單鏈 RNA，參與轉(zhuǎn)錄后基因表達的調(diào)控。研究提出，Lss 通過調(diào)節(jié) miRNAs 來維持內(nèi)皮細胞功能的穩(wěn)定，從而發(fā)揮抗 AS 作用。有鑒于此，需要探討 Lss 敏感的 miR-29b-3p 對內(nèi)皮細胞功能和 AS 形成的影響。

吉林大學人獸共患病研究教育部重點實驗室、新疆醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院免疫學系、吉林大學第一醫(yī)院心血管疾病診治中心的聯(lián)合團隊的一項研究結(jié)合生物信息學、分子生物學和其他研究方法檢測了 Lss 敏感的 miR-29b-3p/CX3CL1 軸，在體外和體內(nèi)探討了該軸對內(nèi)皮細胞炎癥和 AS 發(fā)生發(fā)展的影響，從而提高了對 AS 調(diào)控的認識，為 AS 的防治提供了新的思路和見解。
 

為了探索 Lss 對血管內(nèi)皮細胞功能的影響，實驗確定了在 Lss（12 dyn/cm²）處理的人主動脈內(nèi)皮細胞（HAECs）和 HUVECs 中下調(diào)的 25 個 mRNAs 作為關鍵 mRNAs。

有研究報道，CXCR4、APLN、CX3CL1、CSF1 和 HES1 參與 AS 的發(fā)生和發(fā)展。因此，使用定量實時 PCR（qRT-PCR）來測量靜態(tài)和 Lss 處理的 HAECs 中 CXCR4、APLN、CX3CL1、CSF1 和 HES1 的 mRNA 表達。鑒于CX3CL1 mRNA 表達降低最顯著，于是將 CX3CL1 確定為后續(xù)研究的靶基因。與 HUVECs-static 組相比， HUVECs-Lss 組 CX3CL1 的 mRNA 表達也降低，與實驗中生物合成分析結(jié)果一致。

這表明，Lss 可以降低內(nèi)皮細胞中 CX3CL1 mRNA 和蛋白表達，所以 CX3CL1 是 Lss 敏感基因。

研究報道，內(nèi)皮 CX3CL1 誘導單核細胞粘附，從而破壞血管內(nèi)皮功能。qRT-PCR 和蛋白質(zhì)印跡顯示，與陰性對照組相比，TNF-α 誘導 HAECs 中 CX3CL1、血管細胞粘附分子-1（VCAM-1）和細胞間粘附分子-1（ICAM-1）的 mRNA 和蛋白表達增加。然而，在轉(zhuǎn)染 sh-CX3CL1-1 后，CX3CL1、VCAM-1 和 ICAM-1 的表達受到抑制。此外，降低的 CX3CL1 表達抑制了 TNF-α 刺激的單核細胞粘附的增強。

實驗進一步探討了 Lss 是否通過調(diào)節(jié) CX3CL1 表達影響內(nèi)皮細胞功能。HAECs 轉(zhuǎn)染 CX3CL1 過表達質(zhì)粒（pri-CX3CL1）后，CX3CL1 的 mRNA 表達明顯上調(diào)，說明 CX3CL1 過表達細胞模型成功建立。

Lss 顯著抑制 TNF-α 刺激的 CX3CL1、VCAM-1 和 ICAM-1 mRNA 和蛋白表達的增加，上調(diào) CX3CL1 的表達逆轉(zhuǎn)了 Lss 的抑制作用。此外，對單核細胞粘附的分析表明，CX3CL1 的過表達部分逆轉(zhuǎn)了 Lss 對 TNF-α 刺激的單核細胞粘附增強的抑制作用。

這表明，Lss 通過抑制 CX3CL1 表達損害單核細胞對活化 HAECs 的粘附。

最近的研究表明，受流體剪切應力調(diào)控的 miRNAs 是治療心血管疾病的潛在靶點。因此，為了分析 Lss 依賴性保護內(nèi)皮細胞功能的分子機制，研究檢測了響應 Lss 調(diào)節(jié) CX3CL1 表達的上游 miRNAs。

qRT-PCR 顯示，與 HAECs-static 組相比，Lss 最顯著上調(diào)了 miR-29b-3p 的表達。進一步驗證表明，過表達 miR-29b-3p 抑制 CX3CL1 mRNA 和蛋白表達，而敲低 miR-29b-3p 則促進 CX3CL1 mRNA 和蛋白表達。

這表明，CX3CL1 是 miR-29b-3p 的直接靶點。

隨后，研究探討了 miR-29b-3p 是否在 TNF-α 激活的 HAECs 中調(diào)節(jié) CX3CL1 的表達。qRT-PCR 和蛋白質(zhì)印跡顯示，miR-29b-3p 過表達顯著抑制 TNF-α 誘導的 CX3CL1 mRNA 和蛋白質(zhì)表達升高。此外，miR-29b-3p 過表達還顯著抑制 TNF-α 誘導的 VCAM-1 和 ICAM-1 mRNA 和蛋白質(zhì)表達的增加，以及單核細胞粘附的增強。

為了進一步驗證 miR-29b-3p 是否通過調(diào)節(jié) CX3CL1 表達抑制單核細胞粘附到活化的 HAECs，將 pri-miR-29b-3p 和 pri-CX3CL1 共轉(zhuǎn)染到 TNF-α 激活的 HAECs 中。在 TNF-α 激活的 HAECs 中，CX3CL1 的過表達消除了 miR-29b-3p 對 CX3CL1、VCAM-1 和 ICAM-1 mRNA 和蛋白質(zhì)表達的抑制作用。此外，miR-29b-3p 過表達顯著抑制單核細胞與 TNF-α 激活的 HAECs 的粘附，而 CX3CL1 過表達逆轉(zhuǎn)了這種抑制作用。

鑒于 miR-29b-3p 是 Lss 敏感的 miRNA，還探討了在加載 Lss 的條件下，miR-29b-3p 敲低對內(nèi)皮細胞粘附的影響。在加載 Lss 后，TNF-α 上調(diào)的 CX3CL1、VCAM-1 和 ICAM-1 的 mRNA 和蛋白質(zhì)表達受到抑制，而 miR-29b-3p 的敲低則逆轉(zhuǎn)了這種抑制作用。同樣，miR-29b-3p 敲低也逆轉(zhuǎn)了 Lss 對單核細胞粘附到 TNF-α 激活的 HAECs 的抑制作用。

這表明，Lss 通過調(diào)控 miR-29b-3p/CX3CL1 軸損害單核細胞對活化的 HAECs 的粘附。

有研究提出，一些內(nèi)皮 miRNAs 通過調(diào)節(jié) NF-κB 信號通路來控制細胞粘附分子的轉(zhuǎn)錄，從而影響單核細胞與內(nèi)皮細胞的粘附。為了進一步闡明 Lss 敏感 miR-29b-3p/CX3CL1 軸介導的內(nèi)皮細胞粘附調(diào)節(jié)的分子機制，分析了 Lss、miR-29b-3p 和 CX3CL1 對 TNF-α 激活的 HAECs 中 NF-κB 信號通路的影響。

加載 Lss 后，TNF-α 誘導的 VCAM-1 和 ICAM-1 的上調(diào)受到抑制。此外，Lss 顯著抑制 TNF-α 誘導的 p65 和 IκBα（也稱為 RELA 和 NFKBIA）磷酸化，表明 Lss 可能通過抑制 NF-κB 信號通路的激活來調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞炎癥。

p65 的核轉(zhuǎn)位是激活 NF-κB 信號的關鍵。加載 Lss 后，p65 在 TNF-α 激活的 HAECs 細胞核中的積累顯著減少。此外，免疫熒光分析表明，Lss 顯著降低了 TNF-α 誘導的 p65 核轉(zhuǎn)位。值得注意的是，miR-29b-3p 敲低逆轉(zhuǎn)了 Lss 對 TNF-α 激活的 HAECs 中 NF-κB 信號通路的抑制作用。

實驗還探討了 Lss 敏感的 miR-29b-3p/CX3CL1 軸是否可以調(diào)節(jié) TNF-α 激活的 HAECs 中的 NF-κB 信號傳導。miR-29b-3p 的過表達顯著抑制了 TNF-α 刺激的 VCAM-1 和 ICAM-1 的上調(diào)，以及 p65 和 IκBα 的磷酸化。在 CX3CL1 敲低的 TNF-α 激活的 HAECs 中獲得了相同的結(jié)果。miR-29b-3p 的過表達或 CX3CL1 的敲低減少了 p65 在 TNF-α 激活的 HAECs 的細胞核中的積累。此外，免疫熒光分析還顯示，過表達 miR-29b-3p 或敲低 CX3CL1 顯著降低了 TNF-α 誘導的 p65 核轉(zhuǎn)位。

這表明，Lss 敏感的 miR-29b-3p/CX3CL1 軸通過阻斷 NF-κB 信號通路減輕內(nèi)皮細胞炎癥反應。

為了在體內(nèi)將 Lss 與 miR-29b-3p 和 CX3CL1 聯(lián)系起來，實驗研究了暴露于湍流（Oss）的ApoE^-/- 小鼠主動脈弓內(nèi)膜和暴露于 Lss 的胸降主動脈內(nèi)膜中 miR-29b-3p 和 CX3CL1 的表達水平。結(jié)果表明，與主動脈弓相比，暴露于 Lss 的胸主動脈內(nèi)膜中 miR-29b-3p 的表達上調(diào)，而 CX3CL1 的表達下調(diào)。此外，體外研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)振蕩剪切應力（0.5±4 dyn/cm²）處理的 HAECs 中 CX3CL1 的表達上調(diào)，而 miR-29b-3p 的表達下調(diào)。

為了確認 miR-29b-3p 是否在體內(nèi)調(diào)節(jié) AS 進展，給 6 周大的雄性ApoE^-/- 小鼠喂食正常飲食（ND）或高脂飲食（HFD ）4 個月。隨后檢測 ApoE^-/- 小鼠血清中甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）的濃度。結(jié)果表明，與喂食ND的 ApoE^-/- 小鼠相比，喂食 HFD 的 ApoE^-/- 小鼠血清中 HDL-C 濃度顯著降低，而 TG、TC 和 LDL-C 濃度顯著升高。然而，當 miR-29b-3p 過表達時，HDL-C、TG、TC 和 LDL-C 的濃度恢復。與喂食 ND 的 ApoE^-/- 小鼠相比，喂食 HFD 的 ApoE^-/- 小鼠的主動脈內(nèi)膜表面不光滑。伴隨著內(nèi)膜增厚和較大的斑塊形成，表明 AS 小鼠模型建立成功。然而，當注射 agomir-miRNA-29b-3p 時，喂食 HFD 的 ApoE^-/- 小鼠的主動脈內(nèi)膜斑塊面積顯著減少。

這表明，miR-29b-3p 在體內(nèi)改善 AS。

實驗還探討了 miR-29b-3p 是否通過控制 CX3CL1 的表達來調(diào)節(jié) AS 小鼠的內(nèi)膜炎癥，從而影響 AS 的發(fā)生和發(fā)展。蛋白質(zhì)印跡顯示，miR-29b-3p 的過表達逆轉(zhuǎn)了喂食 HFD 的ApoE^-/- 小鼠主動脈內(nèi)膜中 CX3CL1、VCAM-1 和 ICAM-1 蛋白表達的增加。此外，免疫組化染色顯示，與喂食 ND 的ApoE^-/- 小鼠相比，喂食 HFD 的 ApoE^-/- 小鼠主動脈中 CX3CL1 和 VCAM-1 的表達顯著增加。然而，miR-29b-3p 的過表達下調(diào)了主動脈中 CX3CL1 和 VCAM-1 的表達。

總之，miR-29b-3p 在體內(nèi)減輕了內(nèi)皮細胞炎癥，從而改善 AS。

總之，在喂食 HFD 的 ApoE^-/- 小鼠中，Lss 敏感的 miR-29b-3p/CX3CL1 軸顯著抑制單核細胞與活化的 HAECs 的粘附并減輕局部炎癥和斑塊形成。因此，它是預防和治療 AS 的潛在干預靶點。

參考文獻：Pu L, Meng Q, Li S, Wang Y, Sun B, Liu B, Li F. Laminar shear stress alleviates monocyte adhesion and atherosclerosis development via miR-29b-3p/CX3CL1 axis regulation. J Cell Sci. 2022 Jul 15;135(14):jcs259696. doi: 10.1242/jcs.259696. Epub 2022 Jul 22. PMID: 35735031.

原文鏈接：http://group9-s.ccame.net/35735031/

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