幾種常見的肝臟疾病和常用的動物模型介紹

說到肝臟，大家想到的是什么
是掛在嘴邊“肝到天明”的口頭禪
是體檢不合格項目的�？�“脂肪肝”
還是肝臟獨一無二的再生能力?

......

毫無疑問，肝臟這個詞大家都是不陌生的，但對于肝臟本身大部分人就知之甚少了。實際上，我國是一個肝病大國，平均每12個人里就有一個肝病患者，眾多肝臟疾病的發(fā)病機理和治療藥物還有待探索。今天是世界肝炎日，小編就為大家介紹幾種常見的肝臟疾病和常用的動物模型，助大家在研究中快人一步。
 

01 肝臟簡介

人的肝臟位于上腹部，上與右肺、心臟相鄰，下與胃、十二指腸相鄰，肝是人體最大的消化腺，也是體內(nèi)新陳代謝的中心，據(jù)估計，在肝臟中發(fā)生的化學反應(yīng)有500種以上。肝臟承擔著營養(yǎng)代謝、解毒排毒、分泌膽汁、免疫防御等多種重要的生理功能。
 

肝臟承擔的生理功能重要且繁多，是比較容易“積勞成疾”的器官之一，我國各類肝病的患者加起來有1億多人。常見的肝病包括：脂肪肝、肝實質(zhì)細胞損傷、病毒性肝炎、自身免疫性肝炎、肝硬化和肝癌等。動物模型對于研究肝臟異常和肝臟疾病的病理生理機制，以及確定有效的治療方法和篩選潛在的生物標志物至關(guān)重要。下面，小編為大家分別介紹肝臟研究常用的小鼠模型。
 

02 脂肪肝模型

脂肪肝，大家都不陌生，誰還沒個患脂肪肝的朋友呢...

肝臟是人體的營養(yǎng)中轉(zhuǎn)站，吃下去的食物被消化吸收后會進入肝臟進行代謝。如果吸收的脂肪超過了肝臟的處理能力，它們就會沉積在肝內(nèi)，形成脂肪肝，脂肪肝一般分為酒精性脂肪肝（Alcohol-related liver disease,ALD）和非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)兩大類。

 2.1酒精性脂肪肝模型   
酒精攝入后，少量會立即在胃中代謝，剩余的大部分酒精會被胃腸道吸收，隨后通過靜脈輸送到肝臟。肝臟是酒精代謝的主要器官，它通過幾種酶促和非酶促反應(yīng)機制將90%以上酒精代謝成乙醛[1,2]。乙醛主要由乙醇脫氫酶 (ADH)、細胞色素P450 2E1 (CYP2E1) 和過氧化氫酶產(chǎn)生。乙醛隨后被醛脫氫酶 (ALDH) 轉(zhuǎn)化成乙酸，并從肝臟中釋放出來，被肌肉和心臟代謝[2]。乙醇本身和它的衍生物乙醛可使肝細胞發(fā)生脂肪變性、壞死，攝入的酒精超過肝臟的分解能力會對肝臟造成損傷。ALD模型的構(gòu)建基本都是通過小鼠長期過量攝入酒精來造模的。
 

ALD的主要病理變化

建模小鼠選擇：

• 品系：C57BL/6最佳，BALB/c 及DBA老鼠在造模過程中體重會降低，死亡率較高，不太適用。C57BL/6中，6N又要比6J更易感（6J的乙醛脫氫酶水平較高，酒精代謝較6N好）。

• 性別：雌鼠更適合用于酒精性脂肪肝的造模，因為雌鼠胃乙醇脫氫酶水平低，同時雌激素讓肝Kuffer細胞更容易受到 LPS 和促炎癥因子的影響。

• 周齡：8-11周齡的老鼠（成年鼠）比較適合用于造模，老年肝細胞內(nèi)乙醇脫氫酶、乙醛脫氫酶和CYP2E1活性均降低，更易成模。

 

建模方法：

• 直接在飲用水中加酒精造模：飲用水乙醇量通常開始從5%(v/v)開始逐步提高，小鼠可提高到25.32% (v/v) 的濃度。一般8-10周肝臟出現(xiàn)脂肪變性，長期（數(shù)月）酒精喂養(yǎng)可誘發(fā)氧化應(yīng)激、脂肪變性、輕微的纖維化、炎癥細胞浸潤、肝損傷等。

• Lieber-DeCarli液體酒精鼠糧造模：市面上有各種品牌的特制鼠糧可用于ALD造模。一般來講，喂食4周小鼠肝臟出現(xiàn)輕度脂肪變性，轉(zhuǎn)氨酶輕微升高，少量炎癥。喂食8-12周出現(xiàn)明顯的脂肪肝，伴有輕度炎癥和肝臟損傷，但是一般沒有纖維化[6]。

• 胃內(nèi)插管造模：上述造模方法只能得到早期ALD模型，為了模擬晚期ALD，1984 年 Tsuka moto和同事嘗試了一種新方法，直接通過手術(shù)將插管植入小手術(shù)胃內(nèi)，研究者借此可以完全控制小鼠乙醇攝入量。通過長期將小鼠血液中的酒精維持在250–500 mg/dl 的水平，可以在小鼠上模擬人類 ALD 的病理變化，包括微泡和大泡脂肪，巨線粒體、細胞凋亡、中央壞死和混合炎性浸潤，中央小葉和細胞周圍纖維化，門靜脈纖維化，橋接纖維化等[7]。

• 水/酒自由選擇造模：同時給小鼠提供正常飲用水和含酒精應(yīng)用水（或不同酒精濃度的飲用水）。因為嚙齒動物不會被迫喝酒精來緩解饑餓或口渴，這種方法可以篩選（培養(yǎng)）出小鼠中的“酒鬼”，與人類嗜酒行為更相似。這種模型可以模擬酒精成癮，用于研究分子和神經(jīng)化學途徑導致酒精濫用的行為和成癮機制[3]。
   

 2.2非酒精性脂肪肝模型  
伴隨肥胖人群的激增，非酒精性肝�。∟AFLD）的發(fā)病率在過去20年發(fā)生了一波爆發(fā)式的增長。NAFLD 如果不能得到有效治療，會逐漸進展到非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、肝纖維化（Fibrosis）。此時通過積極干預(yù)，肝臟仍可能恢復(fù)正常，一旦進展到肝硬化（Cirrhosis），將會有約 1~4% 的患者最終進展為肝癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）。目前的假說認為NASH是多種因素共同作用的后果，包括遺傳、肥胖、代謝綜合癥（比如高血壓、高血糖）、心血管疾病、糖尿病等。

 

NAFLD/NASH發(fā)病特征

食源性肥胖和胰島素抵抗是最常見的人類代謝疾病的誘因，各類特制飼料常用在NAFLD/NASH造模中。

• MCD(Methionine- and choline-deficient diet)造模：MCD飲食中缺乏蛋氨酸和膽堿，蛋氨酸是合成半胱氨酸的關(guān)鍵化合物，膽堿是乙酰膽堿的前體，它們是肝臟和成磷脂酰膽堿的必要原料，缺乏磷脂酰膽堿會導致極低密度脂蛋白VLDL無法正常組裝，甘油三酯 (TG)無法轉(zhuǎn)運，在肝臟大量積聚。小鼠MCD飲食3周后通常會出現(xiàn)明顯的脂肪性肝炎，5-8 周后出現(xiàn)明顯的纖維化，10 周后肝臟出現(xiàn)大量壞死性炎癥灶，但MCD模型不會出現(xiàn)NAFLD相關(guān)的代謝綜合征；此外，小鼠喂食 MCD會出現(xiàn)嚴重的體重下降，8周的喂養(yǎng)會失去約40%的體重，很可能是因為代謝亢進[8]。

• CDAA(Choline-deficient L-amino-defined diet)造模：與MCD飲食相似，CDAA也缺乏膽堿，但是CDAA配方含有少量蛋氨酸，因此CDAA誘導花費的時間比MCD飲食長，約在12周后小鼠會出現(xiàn)NASH并伴有纖維化，21周纖維化可以進展到中期，經(jīng)常以 CDAA 為食的嚙齒動物表現(xiàn)出與纖維化相關(guān)的肝腫瘤。相較于MCD造模，CDAA造模進展溫和，可用于研究從 NAFLD 到 NASH 再到 HCC 的進展。值得注意的是，這些病變很少出現(xiàn)在雌性小鼠上[9]。

• HFD(High-fat diet)造模：高脂飲食沒有人為的減少必要營養(yǎng)成分，只是提高了飼料中的脂肪含量，這可以更好的模擬人類肥胖和NAFLD的發(fā)病過程。HFD造模的效果與品系和性別均有關(guān)，通常雄性比雌性更容易肥胖；品系上，C57BL/6 比BALB/c更容易成模。事實上，C57BL/6 小鼠自身具有肥胖、高胰島素血癥和葡萄糖耐受不良的遺傳背景。

• HFD衍生造模：在HFD的基礎(chǔ)上增減飼料成分，以期達到更好的造模效果。例如，去除HFD飼料中的膽堿choline，或在HFD飼料中添加果糖、膽固醇或反式脂肪酸、化合物CCL4等[3]。

 

ALD和 NAFLD/NASH 常用模型的主要特征

除飲食誘導外，我們還可以通過基因修飾的方法，敲除Adh, Ldlr等關(guān)鍵基因，阻斷脂肪代謝來構(gòu)建脂肪肝模型，相關(guān)的基因修飾模型詳見文末表格。

需要注意的是，理想的NAFLD/NASH小鼠模型應(yīng)該能模擬人類NAFLD/NASH的發(fā)病過程，實際上，現(xiàn)有的很多模型僅在組織病理上的變化與臨床 NASH 很相似，但是肝臟的代謝、疾病的成因并不相同。例如，MCD和CDAA誘導雖然可以形成與 NASH 相似的病理組織如肥胖、炎癥、纖維化，然而，臨床 NASH 患者并不會出現(xiàn)膽堿缺乏。此外，MCD小鼠模型會出現(xiàn)體重下降而不是升高的特點，這一點在病理生理學與臨床NASH癥狀相反。
 

03 肝損傷/肝纖維化/肝硬化模型

肝損傷主要指肝實質(zhì)細胞的功能損傷或壞死。臨床肝損傷主要由飲酒、食物中毒、藥物毒性、病毒性肝炎、脂肪肝、肝硬化及膽汁淤積癥等引起。嚴重的急性肝損傷可發(fā)展為肝衰竭，危及生命；慢性肝損傷則可能向肝纖維化、肝硬化、肝癌的終末期發(fā)展。肝纖維化幾乎伴隨著所有的慢性肝疾病。
 

慢性肝病的主要病理變化
 

肝損傷造模一般通過腹腔注射或小鼠尾靜脈注射特定化合物（如：CCl4、APAP、ConA、LPS&D-GalN等）即可，造模周期短。通常肝損傷模型構(gòu)建數(shù)小時后，小鼠即出現(xiàn)急劇的肝細胞死亡、肝衰竭乃及死亡；而低劑量重復(fù)注射化合物則可以緩慢積累肝損傷，導致肝纖維化、肝硬化的產(chǎn)生。

• CCl4誘導：不同劑量的四氯化碳（CCl4）可分別造成小鼠急性或慢性肝損傷發(fā)生。高劑量CCl4在肝細胞內(nèi)經(jīng)過細胞色素p-450依賴性途徑產(chǎn)生有肝臟毒性的自由基代謝產(chǎn)物，從而導致肝損傷；低劑量、多次數(shù)的CCl4注射能夠?qū)е赂渭毎�變性、壞死以、肝臟纖維化及肝硬化發(fā)生。

• APAP誘導：由于臨床上對乙酰氨基酚（APAP）的過量使用是導致病人肝毒性的重要因素，因此，小鼠口服高劑量的APAP也是常用的誘導肝損傷的模型。

• LPS與D-GalN誘導：該模型主要用于研究巨噬細胞作用機制。D-GalN（D-galactosamine，半乳糖苷）作為一種特異性的肝臟致敏劑，能夠參與肝細胞代謝并特異地消耗尿嘧啶，從而抑制細胞的轉(zhuǎn)錄活性，導致NF-κB下游靶基因不能正常表達發(fā)揮抗凋亡作用。腹腔聯(lián)合注射LPS和D-GalN常作為研究巨噬細胞分泌的TNFα誘導急性肝損傷的經(jīng)典模型。

• ConA誘導：ConA（刀豆蛋白）作為一種T細胞絲裂原，能夠激活NK細胞釋放IFN-γ，促進T細胞活化，從而導致急性肝損傷發(fā)生。目前被廣泛應(yīng)用于研究 NKT 細胞在肝臟損傷中作用機制。

 

ConA作用機制
 

• Fah敲除模型：化學物質(zhì)誘導肝損傷通常是劇烈且不可逆的，不能模擬臨床非化學肝毒性因素的肝損傷的病理狀態(tài)和機制，也無法觀察從肝損傷到肝硬化這一漸變過程。通過敲除關(guān)鍵基因構(gòu)建慢性肝損傷模型可以克服這個問題，并可獲得大量特性均一的動物模型，如Fah-KO小鼠（NM-KO-191202），它敲除了延胡索酰乙酰乙酸水解酶(Fumarylacetoacetatehydrolase，F(xiàn)ah)。正常情況下，酪氨酸最終代謝為延胡索酰和乙酰乙酸。Fah基因敲除后，產(chǎn)生有毒的延胡索酰乙酰乙酸鹽和馬來酰乙酰乙酸，并產(chǎn)生其次級代謝產(chǎn)物丙酮，對肝、腎造成損傷，引起肝臟損傷和肝硬化[4]。

 

04 病毒性肝炎模型

病毒性肝炎（viral hepatitis)是由多種不同肝炎病毒引起的一組以肝臟損害為主的傳染病，可分為甲、乙、丙、丁、戊、庚六種類型。其中，乙型病毒性肝炎和丙型病毒性肝炎，多經(jīng)輸血或血制品以及密切接觸傳播，易遷延發(fā)展成慢性甚至肝硬化，已證實乙型（HBV）和丙型（HCV）肝炎病毒感染與肝癌有一定關(guān)系。在此主要介紹HBV和HCV小鼠模型。
 

病毒性肝炎分類

 

 4.1 HBV小鼠模型  

常見HBV小鼠模型造模方法如下：

• lHBV病毒注射：將 HBV 質(zhì)粒 DNA 直接注射到小鼠體內(nèi)，這種造模方法可以制作不同毒株的模型，缺點是穩(wěn)定期短。

• AAV轉(zhuǎn)染：腺病毒包裝HBV基因組，再進行注射，這種方法能形成與臨床相似的免疫耐受，但是小鼠無法重復(fù)感染。

• 人乙肝組織移植：目前最完備的HBV感染模型，可在小鼠上模擬人HBV感染，缺點是手術(shù)復(fù)雜，重復(fù)性差。

• 轉(zhuǎn)基因小鼠：通過基因工程技術(shù)，將HBV基因組敲入小鼠基因組，小鼠模型可終生表達HBV，這種模型的優(yōu)點是穩(wěn)定性高重復(fù)性好，缺點是無法模擬臨床感染過程，無法根除HBV。
   

南模生物將c1型HBV病毒1.0拷貝全長DNA轉(zhuǎn)入小鼠，構(gòu)建了攜帶HBV病毒的轉(zhuǎn)基因小鼠HBV-Tg（貨號：NM-TG-00003）。該轉(zhuǎn)基因小鼠血清中HBsAg呈陽性，但無HBeAg、anti-HBs、anti-HBe或antiHBc表達，無HBV DNA復(fù)制。在該轉(zhuǎn)基因小鼠模型的血清、肝臟和腎臟中可以檢測到穩(wěn)定表達的人乙肝病毒表面抗原，該小鼠模型為研究人類“乙型肝炎”的發(fā)病機制、治療方法與藥物篩選，提供了理想的動物模型和新型研究手段，具有重要的醫(yī)藥應(yīng)用價值。
 

免疫組化檢測HBsAg在肝臟(A)和腎臟(B)中的表達

 4.2 HCV小鼠模型  
HCV只能感染靈長類，長期以來都沒有可用的小動物模型。將 HCV 在人肝細胞膜表面表達的受體基因轉(zhuǎn)入小鼠，可使小鼠感染 HCV，例如人源化小鼠的CD81和OCLN基因(南模貨號：NM-HU-2000107)，可使HCV病毒正常感染小鼠肝臟[10]。還有研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用人源化肝臟小鼠也可以建立HCV感染小鼠模型[5]。

鑒于靈長類和嚙齒類在病毒易感性和感染機制上的差異，病毒模型更多的采用食蟹猴作為模式動物。但在前期的研究中，綜合考慮成本等方面的因素，也可以選擇免疫缺陷小鼠注射相應(yīng)病毒來造模。
 

05 肝癌模型

肝癌的發(fā)生是一個多階段逐漸演變惡化的過程，從最初的肝炎到肝硬化，再到最后的肝癌，是一個多步驟的發(fā)展過程。肝癌模型的構(gòu)建方法較多，可以用化學致癌劑誘導，可以移植肝癌細胞或組織建模，還可以通過修飾關(guān)鍵抑癌基因或原癌基因造模。

 

肝臟病變進展

  5.1誘發(fā)性肝癌模型   

許多化學致癌劑達到足夠的劑量及時間可誘發(fā)動物形成腫瘤。常用的肝癌誘導劑包括：二乙基亞硝胺（DEN）、黃曲霉素B1(AFB1)、四氯化碳（CCl4）等。

誘發(fā)性肝癌模型優(yōu)點：可以模擬腫瘤發(fā)生的3個過程，即損傷，硬化和腫瘤。

誘發(fā)性肝癌模型缺點：誘導周期長，致死率高，個體間肝癌發(fā)生的時間、部位及病灶數(shù)等不均一。

 5.2 移植性肝癌模型   

移植性肝癌小鼠模型是指將小鼠或人的肝癌組織、細胞株或其他惡性腫瘤（如乳腺癌）移植到小鼠體內(nèi)形成的動物模型。是肝癌研究常用的模型之一，適用于抗癌藥物臨床前的藥效評價。
 

PDX模型

目前，常見的移植性肝癌模型主要分為兩種，一種是將人源的肝癌細胞系（HepG2, Hep3B, SMMC-7721, HuH7等）接種到免疫缺陷小鼠體內(nèi)，稱為CDX模型（cell-line-derived xenograft），另一種是將來源于患者的肝癌組織塊接種到免疫缺陷小鼠體內(nèi)，稱為PDX模型（patient-derived xenograft），南模生物已累計構(gòu)建了近百種肝癌PDX模型。

  5.3 基因修飾肝癌模型  
利用基因工程手段構(gòu)建的肝癌小鼠不僅能從動物整體的組織器官水平上進行研究，而且還可以深入到細胞和分子水平，為肝癌的發(fā)病機制、藥物篩選和臨床醫(yī)學研究提供理想的實驗動物模型，南模生物自主構(gòu)建了多種敲除，條件性敲除的肝癌小鼠模型，模型信息詳見文末表格。

 

南模生物深耕基因編輯領(lǐng)域，提供全方位模式生物服務(wù)，包括基因修飾成品模型供應(yīng)、個性化模型定制、飼養(yǎng)繁育、表型分析、藥效評價等，滿足不同實驗室需求。

參考文獻:
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3.Nevzorova YA, Boyer-Diaz Z, Cubero FJ, Gracia-Sancho J: Animal Models for Liver Disease - A Practical Approach for Translational Research. J Hepatol 2020.

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