Evosep One在抗菌素耐藥性研究中的應用
題目：
使用T目標液相色譜-T和質(zhì)譜快速檢測血液培養(yǎng)中大腸桿菌或肺炎克雷伯菌中β-內(nèi)酰胺、氨基糖苷和氟喹諾酮耐藥機制
文章名稱：
Using T argeted Liquid Chromatography-T andem Mass Spectrometry to Rapidly Detectβ-Lactam, Aminoglycoside, and Fluoroquinolone Resistance Mechanisms in Blood Cultures Growing E. coli or K. pneumoniae High-Field Asymmetric Waveform Ion Mobility Spectrometry and Parallel Reaction Monitoring Increases Sensitivity for Clinical Biomarker Quantitation from Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Tumor Biopsies
期刊：bioRxiv
發(fā)表日期：
2022- 02-10
Abstract:
New and rapid antimicrobial susceptibility/resistance testing methods are required for bacteria from positive blood cultures. In this study, a multiplex-targeted liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) assay was developed and validated for the detection of β-lactam, aminoglycoside, and fluoroquinolone resistance mechanisms in blood cultures growing Escherichia coli or Klebsiella pneumoniae complex. Selected targets were the β-lactamases SHV , TEM, OXA-1-like, CTX-M-1-like, CMY -2-like, chromosomal E. coli AmpC (cAmpC), OXA-48-like, NDM, VIM, and KPC; the aminoglycoside-modifying enzymes AAC(3)-Ia, AAC(3)-II, AAC(3)-IV , AAC(3)-VI, AAC(60)-Ib, ANT(200)-I, and APH(30)-VI; the 16S-RMT ases ArmA, RmtB, RmtC, and RmtF; the quinolone resistance mechanisms QnrA, QnrB, AAC(60)-Ib-cr; the wildtype quinolone resistance determining region of GyrA; and the E. coli porins OmpC and OmpF . The developed assay was evaluated using 100 prospectively collected positive blood cultures, and 148 negative blood culture samples spiked with isolates previously collected from blood cultures or isolates carrying less prevalent resistance mechanisms. The time to result was approximately 3 h. LC-MS/MS results were compared with whole-genome sequencing and antimicrobial susceptibility testing results. Overall, there was a high agreement between LC-MS/MS results and whole-genome sequencing results. In addition, the majority of susceptible and non-susceptible phenotypes were correctly predicted based on LC-MS/MS results. Exceptions were the predictions for ciproflox acinand amoxicillin/clavulanic acid that matched with the phenotype in 85.9 and 63.7% of the isolates, respectively. T argeted LC-MS/MS based on parallel reaction monitoring can be applied for the rapid and accurate detection of various resistance mechanisms
in blood cultures growing E. coli or K. pneumoniae complex.
研究背景
從陽性的血液培養(yǎng)中快速識別細菌種類，并進行快速抗菌素敏感性/耐藥性測試，對于早期選擇血流感染患者最合適的治療至關(guān)重要。使用一種可用的樣品制備方法和隨后的基質(zhì)輔助激光解吸/飛行時間(MALDI-TOF)質(zhì)譜分析，可在血液培養(yǎng)呈陽性后半小時內(nèi)進行細菌物種鑒定。目前現(xiàn)有的分析方法雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大約10個耐藥基因，但它們?nèi)匀粵]有發(fā)現(xiàn)其他相關(guān)的耐藥機制，包括小譜青霉素酶和賦予氟喹諾酮類和氨基糖苷類耐藥的機制。使用LC-MS/MS，可以檢測到導致耐藥性的實際蛋白質(zhì)，而不是編碼基因，這對于檢測數(shù)量重要的耐藥機制或僅檢測基因不能提供足夠信息的耐藥機制尤其有用。此外，有針對性的LC-MS/MS分析可以高度復用，適用于一次運行檢測數(shù)百個目標。在本研究中，我們開發(fā)并驗證了一種快速LC-MS/MS分析方法，用于同時檢測血液培養(yǎng)中大腸埃希菌或肺炎克雷伯菌復合物中27種常見的β-內(nèi)酰胺、氨基糖苷和氟喹諾酮耐藥機制。
研究方法
1. 前瞻性采集血液培養(yǎng)
于2019年10月19日至2020年7月19日對伊拉斯謨MC醫(yī)學微生物學系革蘭氏陰性桿菌陽性的血液培養(yǎng)進行前瞻性采樣。共采樣了 144 個連續(xù)培養(yǎng)物。此后，只排除來自同一患者的重復樣本，總共剩下100個樣本。
2. 血培養(yǎng)呈陰性
為了評估LC-MS/MS在檢測不太常見的耐藥性機制方面的準確性，作者在148份陰性的血液培養(yǎng)標本中加入了耐藥性機制不太普遍的分離株。在標記陰性血液培養(yǎng)前，在- 80◦C保存的分離物在5%羊血TrypticaseTM大豆瓊脂II板上繼代培養(yǎng)，在37◦C孵育過夜。隨后，將每種懸液各1ml加入陰性血液培養(yǎng)瓶中，使用BACTEC FX自動血液培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)一夜，隨后用Sepsityper試劑盒與前瞻性采集的血液培養(yǎng)物相同的方法進行預處理。
3. 鑒定和藥敏試驗
除不動桿菌屬(Acinetobacter sp.)由CRBIP提供鑒定數(shù)據(jù)外，所有分離株均在Erasmus MC進行繼代培養(yǎng)和AST鑒定。采用MALDI質(zhì)譜進行鑒定。
4. 全基因組測序及耐藥基因鑒定
采用Microsynth AG對前瞻性收集的(n = 100)和預先收集的(n = 100)血液培養(yǎng)物進行全基因組測序(WGS)。其余48株已通過WGS鑒定。測序采用Illumina NextSeq 500/550測序系統(tǒng)，使用NextSeq 500/550高輸出試劑盒v2.5進行300次循環(huán)。
5. 檢測方法的發(fā)展:耐藥機制的選擇
選擇了大腸桿菌和肺炎克雷伯菌對阿莫西林、第三代頭孢菌素、碳青霉烯類、氨基糖苷類和氟喹諾酮類耐藥的最普遍的抗菌藥物耐藥機制。對氟喹諾酮類藥物的耐藥機制選擇了AAC(60)-Ibcr、QnrA、QnrB和GyrA野生型QRDR。最后篩選出大腸桿菌的孔蛋白OmpC和OmpF。共篩選出27種不同的抗生素耐藥機制。
6. 方法開發(fā):肽選擇
選擇特異性肽用于檢測每種耐藥機制，并將其納入檢測方法。對于SHV、TEM、OXA-1-like、CTX-M-1-like、QnrA和QnrB，首先在硅材料中選擇候選肽)、。然后，對所有候選肽進行實驗測試，并將最高強度和低干擾的最佳性能肽納入分析。所有多肽的穩(wěn)定同位素標記(SIL)多肽變體被納入分析優(yōu)化。
7. 分析方法的開發(fā):穩(wěn)定同位素標記肽的濃度和檢測標準
在先導實驗的基礎(chǔ)上，實驗設(shè)置SIL多肽的濃度，使其接近內(nèi)源性多肽的濃度。此外，設(shè)置以下標準，即質(zhì)量誤差<10 ppm, rdotp >0.95，內(nèi)源性與SIL肽>比值0.01。
8. 試驗開發(fā):(非)敏感性預測標準
根據(jù)檢測到的多肽來預測分離株的易感或不易感，應用以下預測規(guī)則。肺炎克雷伯菌和天花克雷伯菌均被認為對氨芐西林具有內(nèi)在耐藥性TEM或SHV的存在被預測只會導致氨芐西林不敏感。OXA-1的存在被預測會導致對氨芐西林和阿莫西林克拉維酸不敏感。對于氨基糖苷類，應用了與之前報道相同的預測規(guī)則。QnrA、QnrB或AAC(60)-Ib-cr的存在，或GyrA野生型QRDR的缺失，都可能導致環(huán)丙沙星不敏感。
9. 裂解和消化方法
為了驗證分析結(jié)果，將儲存的敗血癥微球(即陽性血培養(yǎng)物使用敗血癥試劑盒進行預處理)懸浮在50µl溶解液中，隨后，添加所有納入肽的SIL變異體。使用布蘭森2510超聲清洗劑超聲5分鐘，在80◦C和450 rpm下孵育10分鐘。為了停止蛋白質(zhì)消化，加入20µl的5%三氟乙酸，在37◦C和450 rpm下孵育樣品5min。最后，4◦C 21000 × g離心10 min，上清液250µl轉(zhuǎn)移到Eppendorf管中，-20◦C保存。
10. 液相色譜- t質(zhì)譜分析
對于每個樣品，20個消化液µl按照制造商的說明書和之前的描述裝載到Evotips上。LC-MS/MS 使用與 Orbitrap 質(zhì)譜儀(Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap，Thermo Fisher Scientific，Bremen，Germany)耦合的 Evosep One(Evosep，Odense，Denmark)進行。采用制造商11.5分鐘(100個樣品/天)的分離方法進行分析。Q Exactive HF系統(tǒng)在PRM模式下工作。依次測量樣品，在測量間隙不沖洗色譜柱。在方法驗證過程中使用了以下設(shè)置，即四極隔離窗口為0.6 m/z單位，自動增益控制目標值為1 × 106離子，最大填充時間為150 ms，在400 m/z時分辨率為15000。所有多肽的歸一化碰撞能為27%。每個肽的保留時間窗口為2min。
11. 數(shù)據(jù)分析
Skyline每日版本20.1或更高版本用于MS分析。檢測開發(fā)完成后，使用達·芬奇實驗室解決方案(荷蘭鹿特丹)開發(fā)的定制軟件工具“抗生素耐藥性掃描儀”分析Skyline的結(jié)果。通過使用該工具，Skyline結(jié)果被導入，并根據(jù)應用的檢測標準進行自動化評估。
研究結(jié)果及討論
在之前的研究中，作者證明了使用LC-MS/MS高精度檢測不同碳青霉烯酶和氨基糖苷類耐藥機制的可能性。在這些研究中，通過檢測選定的特異性多肽來確定耐藥機制，并使用SIL多肽進行自動化分析。此外，利用內(nèi)控肽進行樣品質(zhì)量評估和自動化分析。在這項研究中，在培養(yǎng)大腸桿菌或肺炎克雷伯菌復合分離株的陽性血液培養(yǎng)中，應用類似的條件來檢測這些和額外的耐藥機制，從而省去了耐藥測試之前的再培養(yǎng)/分離步驟，從而導致結(jié)果的時間顯著縮短(圖1)。為了擴大耐藥機制的覆蓋范圍，TEM、SHV、CTX-M、將OXA-1、QnrA和QnrB多肽添加到先前選定的靶標上。圖2為TEM和CTXM的LC-MS/MS光譜示例。在初步實驗中，我們驗證了所有27種選擇的耐藥機制都能在11.5 min的梯度內(nèi)檢測到。在此條件下，所有248株分離株都能檢測到。
圖1. 從陽性血液培養(yǎng)到結(jié)果的當前方案概述
圖2. 選擇用于TEM和CTX-M的多肽的陽性和陰性LC-MS/MS譜
1. 分析驗證:質(zhì)量評估和樣品排除
設(shè)置質(zhì)量控制參數(shù)，排除質(zhì)量不合格的樣品。最低要求是每個蛋白檢測1個SIL多肽，3個內(nèi)質(zhì)控肽均檢測到(大腸桿菌和克雷伯氏菌)。在248個樣本中，3個前瞻性收集的樣本(其中2個混合培養(yǎng))和1個加標樣本(在使用MALDI-TOF進行鑒定之前，也需要更廣泛的提取方案)被排除，因為在初始和重復測量中都遺漏了多個SIL多肽。
此外，排除了其他三個前瞻性采集的樣品(其中一個混合培養(yǎng))，其中至少有一個內(nèi)部質(zhì)量控制肽沒有檢測到。因此，我們使用241個樣品進行分析。
2. 分析驗證:質(zhì)譜分析結(jié)果與全基因組測序結(jié)果的比較
將LC-MS/MS對剩余241份樣品的抗性機制檢測結(jié)果與WGS的結(jié)果進行比較。對于β-內(nèi)酰胺酶CTX-M-1-like、OXA-1、CMY-2-like和4種碳青霉烯酶KPC、OXA-48、NDM和VIM，與WGS分析相比，靈敏度為100%。在106株含有TEM基因的分離株中，104株檢測到β-內(nèi)酰胺酶。66株攜帶SHV基因的分離株中有7株未檢測到SHV β-內(nèi)酰胺酶。在155個大腸桿菌分離株中，有11株檢測到AmpC β-內(nèi)酰胺酶的染色體編碼。除了對β-內(nèi)酰胺酶的高敏感性外，該方法對CTX-M-1-like、OXA-1、NDM和VIM的特異性為100%，對SHV的特異性為96.6%，對TEM的特異性為95.6%，對CMY-2-like的特異性為98.7%，對KPC的特異性為99.1%，對OXA-48的特異性為99.6%。
16SRMTases和AMEs對氨基糖苷類耐藥機制的敏感性均為100%，AMEs對AAC(3)-Ia、AAC(3)-IV和AAC(3)-VI的敏感性分別為100%。在其他AMEs中，AAC(3)-II的敏感性為97.6%，AAC(60)-Ib為97.7%，ANT(200)-Ia為90.9%，APH(30)-VI為66.7%。RmtB、RmtC、RmtF、AAC(3)-IV、AAC(3)-VI、APH(30)-VI的特異性為100%，ArmA、AAC(3)-Ia、ANT(200)-Ia的特異性為99.6%，AAC(3)-II的特異性為98.0%，AAC(60)-Ib的特異性為99.5%。
對氟喹諾酮耐藥機制的敏感性，QnrA為80.0%，QnrB為84.6%，AAC(60)-Ibcr為100%。野生型QRDR檢測的總靈敏度為82.8%，大腸桿菌為80.6%，肺炎克雷伯菌和水痘克雷伯菌為86.0%。野生型QRDR、QnrA、QnrB和AAC(60)-Ibcr的特異性分別為100%、100%、99.1%和99.5%。除了GyrA野生型QRDR區(qū)域定義肽的檢測外，其他耐藥機制在不同細菌種類的比較中測試性能無差異。
3. 分析驗證:差異分析
為了研究LC-MS/MS和WGS之間的差異結(jié)果，所有假陰性的PRM結(jié)果都被手動重新分析，以區(qū)分弱信號或發(fā)散信號與無光譜。在大多數(shù)假陰性結(jié)果的樣本中，沒有發(fā)現(xiàn)匹配的光譜。例外情況為:1株菌株SHV檢測到微弱信號或發(fā)散信號，1株菌株AAC(60)-Ib檢測到微弱信號，1株菌株APH(30)-VI檢測到微弱信號，2株菌株QnrB檢測到發(fā)散信號。在所有分離株中，檢測到的光譜rdotp值低于0.95，與SIL多肽的比值低于0.01。
對于有假陽性肽鑒定的樣品，通過人工重新分析和重新測量來區(qū)分攜帶肽、檢測背景噪聲或清晰光譜，表明相應的基因可能沒有被WGS檢測到。CMY-2-like、KPC、ArmA、AAC(3)-II和ANT(200)-Ia的假陽性命中和QnrB的一個假陽性命中表明是在初始樣本分析中結(jié)轉(zhuǎn)的結(jié)果，即由于高陽性樣本先于陰性樣本。此外，SHV的兩種鑒定和TEM的一種鑒定，OXA-48-like、AAC(3)-Ia和QnrB在重新測量時沒有被鑒定出來，這可能是由于檢測到背景噪聲或Evotips初始預處理或加載時的樣品污染造成的。然而，其他5個TEM鑒定、4個SHV鑒定和AAC(60)-Ib鑒定均被證實，重新測量顯示的光譜與“真陽性”相似，表明這些耐藥機制的存在，而相應的基因未被WGS檢測到。
4. 分析驗證:質(zhì)譜結(jié)果與抗菌藥物敏感性T檢測結(jié)果的比較
將液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)果與VITEK 2結(jié)果進行比較，以評估建立的檢測方法在預測(非)對所選抗生素敏感性方面的能力(表4)。在亞胺培南、美羅培南、慶大霉素和妥布霉素的敏感表型預測中，超過97.0%的菌株與VITEK 2一致。
此外，93.0%氨芐西林、94.0%阿莫西林-克拉維酸、91.7%頭孢噻肟和93.7%頭孢他啶的易感表型預測結(jié)果與VITEK 2一致。75.7%的菌株對環(huán)丙沙星敏感。97.4%的氨芐西林分離株的不敏感表型預測結(jié)果與VITEK 2結(jié)果一致，而阿莫西林-克拉維酸分離株的不敏感表型預測結(jié)果僅與VITEK 2結(jié)果一致，而阿莫西林-克拉維酸分離株的不敏感表型預測結(jié)果與VITEK 2結(jié)果一致。此外，頭孢噻肟91.0%、頭孢他啶92.3%、美羅培南100%、亞胺培南100%、慶大霉素95.4%、妥布霉素98.6%、環(huán)丙沙星93.9%的分離株預測結(jié)果一致。
對于β-內(nèi)酰胺和氨基糖苷不正確的非易感預測(即主要錯誤)部分是由于結(jié)轉(zhuǎn)造成的假陽性結(jié)果，例如，CMY、KPC或AAC(3)-II選擇的多肽之一的結(jié)轉(zhuǎn)。此外，雖然幾種已鑒定的β-內(nèi)酰胺酶確實導致最低抑制濃度(MICs)增加，但MICs仍屬于敏感范疇。例如，在9個對頭孢噻肟敏感的大腸桿菌分離株中發(fā)現(xiàn)了大腸桿菌cAmpC，其中3個分離株也對頭孢他啶敏感。其中2株的mic≤0.12 mg/L，只有QPVTQQTLFELGSVSK在0.02或更小的比值下被檢測到。在所有其他的cfc陽性分離株中，頭孢他啶的兩種多肽均檢測到這一機制，其比例至少為0.60,mic≥1 mg/L，表明cAmpC表達，但不足以導致頭孢噻肟耐藥。因此，僅檢測cAmpC多肽而不進行定量，無法準確預測這些分離株對頭孢噻肟和頭孢他啶的耐藥性。
同樣，OXA-48-like的存在被正確檢測到，并導致mic高于美羅培南的篩選斷點，但它沒有導致3個分離株對亞胺培南和4個分離株對美羅培南產(chǎn)生耐藥性，因為OXA-48限制了碳青霉烯酶活性，導致亞胺培南和美羅培南的mic有限增加。
根據(jù)目前耐藥機制的存在或不存在，無法準確預測阿莫西林-克拉維酸的耐藥性。在77株大腸桿菌和肺炎克雷伯菌復合菌株中，經(jīng)LC-MS/MS鑒定僅含有SHV和/或TEM的β內(nèi)酰胺酶，59株菌株具有阿莫西林-克拉維酸耐藥。19株敏感菌株GyrA QRDR野生型肽假陰性，預測結(jié)果不敏感。
此外，在具有YHPHGDAAVYDTIVR、YHPHGDLAVYDTIVR或YHPHGDLAVYNTIVR的5個分離株中，正確地排除了QRDR野生型，但這只導致MIC略有增加(n = 4, MIC 0.12-0.25 mg/L)或根本沒有增加(n = 1, MIC≤0.06 mg/L)。
不正確的易感預測(即非常重大的錯誤)主要是由所含多肽未涵蓋的耐藥機制引起的。例如，blaCTX−M−14、blaCTX−M−27和blha−1也導致氨芐西林和頭孢菌素耐藥，AAC(60)-Ie-APH(200)-Ia是唯一錯誤的托布霉素敏感預測。此外，在5個環(huán)丙沙星非敏感分離株中，發(fā)現(xiàn)了qnrS基因，而該檢測中所包含的耐藥機制不存在。
5. 蛋白分析
許多指示性抗生素被用于篩選特定的耐藥機制。對于沒有孔，沒有合適的和具體的指示抗生素可用。因此，這種抵抗機制經(jīng)常被忽略�？椎赖鞍椎娜笔刮⑸飳Χ喾N抗生素產(chǎn)生耐藥選擇，包括第三代頭孢菌素類和碳青霉烯類抗生素。因此，我們用多肽來篩選大腸桿菌中是否存在OmpC和OmpF。在大多數(shù)大腸桿菌分離株中，OmpC的4個多肽均被檢測到(n = 127)。在21株大腸桿菌分離株中，3個肽段檢測到OmpC, 5株分離株2個肽段檢測到OmpC。只有2個分離株未檢測到OmpC多肽，其中1個分離株也未檢測到OmpF多肽。該特異性分離株對阿莫西林-克拉維酸、頭孢噻肟和頭孢他啶耐藥，但未檢測到β-內(nèi)酰胺酶。84株大腸桿菌分離株中2個肽段檢測到OmpF, 36株分離株中1個肽段檢測到OmpF, 35株分離株中2個肽段均未檢測到OmpF。
研究結(jié)論
綜上所述，作者開發(fā)了一個有針對性的LC-MS/MS工作流程，可以檢測各種β-內(nèi)酰胺、氨基糖苷和氟喹諾酮耐藥機制。結(jié)果表明，LC-MS/MS可用于快速檢測陽性血培養(yǎng)菌的耐藥機制。未來的工作應該集中在檢測自動化、實驗室實施和患者利益和成本效益的論證上。最后，可以將額外的多肽納入對額外抗菌素(如甲氧芐啶-磺胺甲惡唑)的耐藥性機制，以及其他細菌物種的耐藥性機制，使開發(fā)的工作流程更加普遍適用。
參考文獻
Foudraine, Dimard E., et al. "Using Targeted Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry to Rapidly Detect β-Lactam, Aminoglycoside, and Fluoroquinolone Resistance Mechanisms in Blood Cultures Growing E. coli or K. pneumoniae." Frontiers in Microbiology 13 (2022).
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