機械應(yīng)變通過信號通路調(diào)節(jié)二尖瓣膜間質(zhì)細(xì)胞中促纖維化表型

與其他心臟瓣膜一樣，房室二尖瓣是一個復(fù)雜的多層結(jié)構(gòu)，每一層都包含特定的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）成分。二尖瓣由成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞組成，稱為瓣膜間質(zhì)細(xì)胞（VIC），它們與 ECM 密切接觸，因此在每次心跳時都會發(fā)生影響瓣膜的機械變形，平均每年 4000 萬次。

粘液瘤二尖瓣（MMV）是最常見的心臟瓣膜疾病，65歲以后，其患病率顯著增加 。MMV 的特征是多個瓣膜結(jié)構(gòu)的破壞、Ki-67 陽性增殖細(xì)胞的密度增加和 ECM 的改變，特別是纖維層中膠原纖維的積累和分解，彈性纖維的斷裂等。

目前越來越認(rèn)識到機械應(yīng)力是軟結(jié)締組織重塑的主要病因之一，包括在 MMV 中觀察到的病理性重塑。各種體外和離體研究調(diào)查了人類和動物 VIC 對機械負(fù)荷的表型反應(yīng)�？傊�，它們顯示出 VIC 對 SMC 表型的激活，蛋白聚糖（PGs）、糖胺聚糖（GAG）和膠原蛋白的合成增加，以及蛋白水解酶的表達和活性增加。

盡管這些研究清楚地表明機械應(yīng)力在瓣膜 ECM 重塑中起基本作用，但在人類二尖瓣 VIC 中很少研究將機械信號轉(zhuǎn)導(dǎo)成驅(qū)動組織重塑的生化信號的機制。比利時列日大學(xué) GIGA 研究所的一項研究旨在識別受循環(huán)機械變形調(diào)控的基因以及參與其調(diào)控的下游信號通路。這些數(shù)據(jù)應(yīng)該可以更好地理解 MMV 進展的機制，并可能揭示藥物治療的新靶點。
 

循環(huán)拉伸增加 TGFβ2、αSMA 和 CTGF/CCN2 的表達

將循環(huán)機械應(yīng)變施加到 VIC 上，VIC 在補充有 0.1% FBS 的培養(yǎng)基中進行 14% 的循環(huán)等雙軸伸長，拉伸幅度保持在生理范圍內(nèi)，頻率為 1.16 Hz，持續(xù) 1、2、4 或 8 h。除機械拉伸（靜態(tài)培養(yǎng)）外，對照培養(yǎng)平行進行。通過 qRT-PCR 研究 MMV 和力學(xué)生物學(xué)相關(guān)基因的表達。

雖然 TGFβ1 的表達在任何時間點都沒有被機械拉伸改變（圖1 A ），但 TGFβ2 和 αSMA 的 mRNA 水平在拉伸 1 h 后顯著增加，然后恢復(fù)到靜態(tài)培養(yǎng)值（圖1 B-C）。

CTGF/CCN2 是一種基質(zhì)細(xì)胞蛋白。作為一種生長因子，它促進 ECM 積累并參與許多纖維化疾病。在實驗?zāi)Ｐ椭�，拉�?1 h 和 2 h 后，在 mRNA 水平上已經(jīng)觀察到非常顯著的 CTGF 表達刺激（圖1 C），并持續(xù)到 4 和 8 h，并逐漸下降。蛋白質(zhì)印跡顯示，蛋白質(zhì)產(chǎn)生與 mRNA 水平平行，有輕微延遲（圖1 E-F）。這些數(shù)據(jù)清楚表明， CTGF 是一種特殊的機械響應(yīng)標(biāo)志物，有助于研究VIC對機械變形響應(yīng)的分子機制。

在其他測試的基因中，TGFβ3、COL1A1、SOD1 和 MMP1，沒有發(fā)現(xiàn)在實驗條件下受到顯在調(diào)節(jié)。
 

圖1 機械拉伸誘導(dǎo) TGFβ2、αSMA 和 CTGF 過表達：通過 qRT-PCR 檢測機械拉伸和靜態(tài)條件下，時間延長后 VIC 中 TGFβ1（A）、TGFβ2（B）、αSMA（C）和 CTGF（D）的表達。使用微管蛋白作為蛋白負(fù)荷控制，靜態(tài)（—）和拉伸（+）VIC 中 CTGF 產(chǎn)生的代表性蛋白質(zhì)印跡結(jié)果（E）。

小 RhoGTPase RhoC，但不是 RhoA，參與機械應(yīng)力誘導(dǎo)的 CTGF 上調(diào)

RhoA 家族的小 GTPase 是關(guān)鍵的分子開關(guān)，參與細(xì)胞外環(huán)境和細(xì)胞骨架動力學(xué)發(fā)出的機械信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)。實驗通過用 siRNA 沉默 RhoA、RhoC、Rac1 和 Cdc42 的表達，研究它們在機械應(yīng)力誘導(dǎo)的 CTGF 上調(diào)中的作用。RhoA、RhoC 和 Rac1 的 SiRNA 有效且特異性地沉默了它們的靶標(biāo)（圖2 A）。

在靜態(tài)細(xì)胞中，通過沉默 Rac1 和 RhoA 降低了 CTGF 的基礎(chǔ)水平，而抑制 RhoC 沒有影響（圖2 B）。然后，在每種情況下比較了循環(huán)拉伸（黑條）與靜態(tài)培養(yǎng)的效果。在對照細(xì)胞中，CTGF 的表達在循環(huán)拉伸時增加（圖2 B ）。盡管在 siRac1 和 siRhoA 轉(zhuǎn)染的 VIC 中基礎(chǔ) CTGF 表達降低，但其通過拉伸誘導(dǎo)的倍數(shù)與對照細(xì)胞相似，甚至略高，表明 Rac1 和 RhoA 不參與拉伸誘導(dǎo)的 CTGF 上調(diào)。相比之下，轉(zhuǎn)染 siRhoC 的細(xì)胞沒有反應(yīng)，這表明 RhoC 在機械拉伸觸發(fā)的調(diào)控中具有特定意義（圖2 B）。

為了進一步支持 RhoC 在機械信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用，進行了下拉測定，該測定允許測量 GTP 連接的活性 RhoC。如圖2 C-D 所示，在拉伸 10 分鐘后觀察到活性 RhoC 的比例增加。Y27632 是 ROCK1/2 的特異性強效抑制劑，ROCK1/2 是 RhoA 和 RhoC 的主要效應(yīng)因子，作用于參與肌動蛋白聚合的下游通路。它沒有改變靜態(tài)條件下 CTGF 的基礎(chǔ)表達，但抑制了應(yīng)激誘導(dǎo)的 CTGF 上調(diào)，無論是在 mRNA（圖2 E）或蛋白質(zhì)水平（圖2 F-G）。由于 RhoA 在這個過程中是可有可無的（圖2 B），這進一步證實了 RhoC 參與了 VIC 對機械信號的響應(yīng)。
 

圖2 RhoC 通過 ROCK1/2 調(diào)節(jié)機械應(yīng)力誘導(dǎo)的 CTGF 表達。

MEK/Erk 通路被機械應(yīng)力激活，獨立于 RhoC 和 ROCK，并參與 CTGF 上調(diào)

在實驗?zāi)Ｐ椭性u估了細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（Erk1/2），因為它們是細(xì)胞外環(huán)境發(fā)出的許多信號的關(guān)鍵二級信使。在機械拉伸 5 分鐘后已經(jīng)觀察到 Erk1/2 的快速和瞬時磷酸化（圖3 A），并在 15 分鐘后恢復(fù)到基礎(chǔ)值。U0126 對 Erk1/2 的上游激活劑 MEK 的抑制有效地抑制了 VIC 中 Erk1/2 的磷酸化。雖然這種抑制劑在靜態(tài)條件下沒有改變 CTGF 的基礎(chǔ)水平，但它在循環(huán)拉伸時完全消除了其 mRNA 和蛋白質(zhì)過表達（圖3 B-D）。

為了評估 MEK/Erk 通路的激活是否取決于 RhoC/ROCK 通路，在用 siRhoC 轉(zhuǎn)染并進行機械拉伸 10 分鐘的 VIC 中測量 Erk1/2 的磷酸化。如圖3 E 和 3F 所示，在拉伸條件下，在 siRhoC 和 siScramble 轉(zhuǎn)染細(xì)胞中，Erk1/2 磷酸化水平相似。因此，用 ROCK 抑制劑 Y27632 處理拉伸的 VIC 不會影響 Erk 1/2 的活化（圖3 G-H）。這些結(jié)果表明，通過機械應(yīng)力激活 Erk1/2 通路與 RhoC/ROCK 軸無關(guān)。
 

圖3 MEK/Erk1/2 信號由機械應(yīng)力激活，獨立于RhoC 和 ROCK，并參與應(yīng)力誘導(dǎo)的 CTGF 表達。

循環(huán)拉伸誘導(dǎo) MRTF-A 的核轉(zhuǎn)位

由于 RhoGTPases/ROCK1/2 是基于肌動蛋白的細(xì)胞骨架動力學(xué)的關(guān)鍵調(diào)控因子，假設(shè)機械拉伸可能通過招募球狀肌動蛋白分子刺激纖維肌動蛋白的形成，這將導(dǎo)致 MRTF-A（心肌素相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子A）從其與球狀肌動蛋白的復(fù)合物中釋放。一旦游離在細(xì)胞質(zhì)中，MRTF-A 就被轉(zhuǎn)運到細(xì)胞核中，在那里它與 SRF 結(jié)合以激活靶基因的轉(zhuǎn)錄，特別是 CTGF。通過對靜態(tài)和拉伸狀態(tài)下細(xì)胞中的 MRTF-A進行免疫染色（圖4 A）和相對于細(xì)胞的總熒光定量核標(biāo)記（圖4 B）來評估該過程。

在靜態(tài)培養(yǎng)中，>40% 的細(xì)胞的細(xì)胞核中 MRTF-A 含量非常低，只有 3% 的細(xì)胞具有更強的核標(biāo)記。機械拉伸后，百分比完全相反，證明了 MRTF-A 的核易位。

MRTF-A 核易位抑制劑 CCG1423 抑制了拉伸細(xì)胞中 CTGF 的上調(diào)（圖5 A-C ），而不影響其在靜態(tài)培養(yǎng)物中的基礎(chǔ)表達。用顯示阻斷 CTGF 表達的 3 種抑制劑（Y-27632、CCG1423、U0126）處理拉伸培養(yǎng)物有效地消除了增加的 MRTF-A 核轉(zhuǎn)位（圖5 D-E）。
 

圖4 循環(huán)拉伸誘導(dǎo) MRTF-A 核易位。具有低 MRTF-A 熒光的細(xì)胞核用箭頭表示，而那些具有強 MRTF-A 熒光的細(xì)胞核用星號表示（A）。在 4 個獨立實驗中，相對于對 58 個（靜態(tài)）和 45 個（拉伸）細(xì)胞測量的細(xì)胞總熒光（%），MRTF-A 的核熒光（nf）染色的細(xì)胞分布（%）（B）。
 

圖5 抑制 MRTF-A 易位消除了拉伸誘導(dǎo)的 CTGF 過表達。

CTGF 誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)基因的表達

為了評估 VICs 是否可以對 CTGF 有反應(yīng)，用重組人 CTGF 處理單層培養(yǎng)物。處理 48 h 后，已知 CTGF 靶基因 COL1A1 和纖維調(diào)節(jié)蛋白的表達顯著上調(diào)（圖6 A-B）。有趣的是，CTGF 還誘導(dǎo)了其自身表達和 CCN 家族的另一成員 Cyr61/CCN1 的表達（圖6 C-D）。

實驗最后測試了可能受 CTGF 調(diào)控的其他基因，例如 PAI-1、TIMP1 和蛋白聚糖，例如 versican、 biglycan、lumican 和 decorin。在實驗環(huán)境中，它們都沒有受到調(diào)節(jié)，顯示 VIC 對 CTGF 的反應(yīng)具有特異性。
 

圖6 CTGF 促進ECM基因及其自身的表達。在用人重組 CTGF（30 ng/ml）處理 48 小時的 VIC 中測量 COL1A1（A）、纖維調(diào)節(jié)蛋白（B）、CTGF（C）和 Cyr61（D）mRNA 的表達。
 

圖7 圖形概要

總之，該研究結(jié)果首次顯示 RhoC/ROCK/MRTF-A 軸的核心作用，它與 MEK/Erk1/2 一起通過機械應(yīng)變調(diào)節(jié)二尖瓣膜間質(zhì)細(xì)胞中促纖維化表型的誘導(dǎo)。一系列的 MRTF-A 抑制劑已開發(fā)和證明是治療硬皮病等纖維化疾病的潛在新療法。根據(jù)該實驗的原始數(shù)據(jù)，MMV 的藥理學(xué)治療是否可以成為這些抑制劑的另一種治療應(yīng)用是值得研究的。

參考文獻：Blomme B, Deroanne C, Hulin A, Lambert C, Defraigne JO, Nusgens B, Radermecker M, Colige A. Mechanical strain induces a pro-fibrotic phenotype in human mitral valvular interstitial cells through RhoC/ROCK/MRTF-A and Erk1/2 signaling pathways. J Mol Cell Cardiol. 2019 Oct;135:149-159. doi: 10.1016/j.yjmcc.2019.08.008. Epub 2019 Aug 20. PMID: 31442470.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31442470/

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