KDM6A/SOX9信號(hào)通路對(duì)BMSCs對(duì)OA的治療效果的改善

作為一種影響全球數(shù)百萬人生活的慢性疾病，骨關(guān)節(jié)炎（OA）主要誘發(fā)殘疾，關(guān)節(jié)僵硬和疼痛。OA 的藥物治療主要使用非甾體抗炎藥來緩解 OA 引起的疼痛和炎癥。然而，許多 OA 患者在疾病的后期階段需要關(guān)節(jié)置換療法。

骨髓來源的 MSCs（BMSCs）是一種來自骨髓的間充質(zhì)干細(xì)胞，具有多能分化潛能，還可以進(jìn)行自我更新，產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)，已被廣泛用于軟骨損傷和關(guān)節(jié)疾病的治療。此外，BMSCs 已在實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)中用于治療 OA。雖然 BMSCs 在治療 OA 中的詳細(xì)機(jī)制尚不清楚，但懷疑 BMSCs 通過分泌一系列免疫因子和細(xì)胞因子來發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用。

缺氧可導(dǎo)致新陳代謝水平升高。在缺氧環(huán)境中培養(yǎng) MSCs 期間，細(xì)胞顯示出一組獨(dú)特的分化，增殖和衰老特性。除此之外，MSCs 和 BMSCs 在低濃度氧氣條件下的分化行為可以幫助我們了解這些細(xì)胞在嚴(yán)重缺氧下的修復(fù)潛力。然而，當(dāng) MSCs 和 BMSCs 被植入嚴(yán)重缺氧的環(huán)境中時(shí)，它們有時(shí)無法正確區(qū)分。

UTX 基因中的純合性缺失突變，也稱為賴氨酸特異性去甲基化酶6A（KDM6A），已在許多原發(fā)性腫瘤中發(fā)現(xiàn)。SOX9 是一種軟骨轉(zhuǎn)錄因子，其信號(hào)激活水平降低是由 OA 發(fā)病機(jī)制期間關(guān)節(jié)軟骨的嚴(yán)重?fù)p傷引起的。

據(jù)報(bào)道，缺氧暴露可激活 KDM6A 的表達(dá)，KDM6A 隨后使 SOX9 啟動(dòng)子去甲基化。SOX9 的下調(diào)參與 OA 的發(fā)病機(jī)制。因此，同濟(jì)大學(xué)附屬上海市第四人民醫(yī)院骨科、同濟(jì)大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院、上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院骨科的研究課題組曾建立了 OA 動(dòng)物模型，并在正常氧或缺氧下與 BMSCs 共培養(yǎng)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞（ACCs）進(jìn)行治療，以研究 BSMC 預(yù)處理對(duì) OA 的治療效果。
 

與 BMSCs 共培養(yǎng)可提高 ACCs 的軟骨分化

在常氧或缺氧條件下，在單一培養(yǎng)和與 BMSCs 共培養(yǎng)下測量 ACC 顆粒的大小和重量。如圖1所示，通過與 BMSCs 共培養(yǎng)，ACC 顆粒的尺寸（圖1 a）和重量（圖1 b）增加。此外，作為軟骨分化的主要參與者，發(fā)現(xiàn)在缺氧條件下與 BMSCs 共培養(yǎng)的 ACCs 中 S-GAG（硫酸化糖胺多糖）水平顯著升高（圖1 c）。此外，通過與 BMSCs 共培養(yǎng)，ACCs 的增殖速率顯著提高（圖1 d）。
 

圖1 sGAG 檢測表明，與 BMSCs 共培養(yǎng)可增強(qiáng) ACCs 的軟骨分化。

與 BMSCs 共培養(yǎng)的 ACCs 中 KDM6A 和 SOX9 的表達(dá)增加

定量 RT-PCR 和蛋白質(zhì)印跡分析 KDM6A 和 SOX9 的表達(dá)。缺氧條件下，KDM6A mRNA 在與 BMSCs 共培養(yǎng)的 ACCs 中顯著上調(diào)（圖2 a）。同樣，在缺氧下與 BMSCs 共培養(yǎng)，ACCs 中的 SOX9 mRNA 表達(dá)也升高（圖2 b）。蛋白質(zhì)印跡分析顯示 KDM6A 和 SOX9 的蛋白質(zhì)表達(dá)趨勢相似（圖2 c）。
 

圖2 定量實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 和蛋白質(zhì)印跡表明，在正常氧和缺氧條件下，KDM6A 和 SOX9 在與 BMSCs 共培養(yǎng)的 ACCs 中表達(dá)增加。

2型膠原蛋白和 Aggrecan mRNAs 在與 BMSCs 共培養(yǎng)的 ACCs 中的表達(dá)升高

此外，在常氧和缺氧下，在單一培養(yǎng) ACCs 和與 BMSCs 共培養(yǎng)的 ACCs 中評(píng)估了 2型膠原蛋白和 Aggrecan（軟骨蛋白聚糖）的 mRNA 表達(dá)。缺氧條件下，2型膠原蛋白（圖3 a）和 Aggrecan（圖3 b）的 mRNA 表達(dá)在與 BMSCs 共培養(yǎng)的 ACCs 中上調(diào)。
 

圖3 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 表明，在正常氧和缺氧條件下，與 BMSCs 共培養(yǎng)的 ACCs 中，2型膠原和 Aggrecan 的 mRNA 表達(dá)增強(qiáng)。

在與 BMSCs 共培養(yǎng)的 ACCs 中，SOX9 啟動(dòng)子的 DNA 甲基化降低

基因啟動(dòng)子中的 DNA 甲基化可以對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行負(fù)調(diào)節(jié)。如圖4 所示，進(jìn)行了亞硫酸氫鹽測序 PCR，以分析在各種條件下處理的 ACCs 中 SOX9 啟動(dòng)子的 DNA 甲基化狀態(tài)。缺氧條件下，與 BMSCs 共培養(yǎng)的 ACCs 中，SOX9 啟動(dòng)子的 DNA 甲基化顯著降低。
 

圖4 亞硫酸氫鹽測序PCR 表明，在正常氧和缺氧狀態(tài)下，與 BMSCs 共培養(yǎng)的 ACCs 中 SOX9 啟動(dòng)子的 DNA 甲基化降低。

與 BMSCs 共培養(yǎng)抑制了 ACCs 的凋亡

使用流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估 ACCs 在不同條件下的凋亡狀態(tài)。如圖5 所示，在缺氧狀態(tài)下與 BMSCs 共培養(yǎng)顯著抑制了 ACCs 的凋亡。這些結(jié)果表明，ACCs 和 BMSCs 的共培養(yǎng)顯著抑制了 ACCs 的凋亡。
 

圖5 流式細(xì)胞術(shù)表明，在正常氧和缺氧狀態(tài)下，與 BMSCs 共培養(yǎng)可降低 ACCs 的凋亡。

ACCs 與 BMSCs 共培養(yǎng)可減輕軟骨損傷

建立 OA 大鼠模型，并在正常和缺氧條件下 BMSCs 與 ACCs 共培養(yǎng)。對(duì) OA 大鼠模型軟骨病變進(jìn)行 Mankin 病理評(píng)分（骨性關(guān)節(jié)炎軟骨退變程度進(jìn)行評(píng)價(jià)的通用標(biāo)準(zhǔn)），發(fā)現(xiàn) OA 大鼠中顯示出顯著更高的 Mankin 評(píng)分。在缺氧下用 ACCs 與 BMSCs 共培養(yǎng)后，OA 大鼠的 Mankin 評(píng)分顯著降低（圖6）。
 

圖6 軟骨病變的 Mankin 分級(jí)表明，在正常氧和缺氧下，BMSCs 與 ACCs 共培養(yǎng)可減弱 OA 大鼠軟骨病變。

BMSCs 與 ACCs 共培養(yǎng)增加了 OA 大鼠 KDM6A 和 SOX9 的表達(dá)

使用 qPCR 檢查 KDM6A 和 SOX9 在 OA 大鼠中的 mRNA 表達(dá)。OA 大鼠 KDM6A 和 SOX9 的 mRNA 表達(dá)明顯被抑制，而在正常氧和缺氧下，ACCs 與 BMSCs 共培養(yǎng)的 OA 大鼠 KDM6A（圖7 a）和 SOX9（圖7 b）的表達(dá)顯著增加。此外，在不同條件下評(píng)估了 SOX9 啟動(dòng)子的 DNA 甲基化。OA 大鼠 SOX9 啟動(dòng)子的 DNA 甲基化逐漸增加，而在正常氧和缺氧下 ACCs 與 BMSC 共培養(yǎng)的 OA 大鼠中 SOX9 啟動(dòng)子的 DNA 甲基化降低（圖7 c）。
 

圖7 定量實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 和亞硫酸氫鹽測序 PCR 表明，與 BMSCs 共培養(yǎng)的 ACCs 處理增加了 OA 大鼠 KDM6A 和 SOX9 mRNA 的表達(dá)。

總之，該研究數(shù)據(jù)表明，缺氧通過促進(jìn) KDM6A 表達(dá)和激活 SOX9 信號(hào)通路來改善 BMSCs 的分化和增殖。這是 BMSCs 分化的一種新機(jī)制，為 OA 治療帶來了光明的前景。

參考文獻(xiàn)：Zhi Z, Zhang C, Kang J, Wang Y, Liu J, Wu F, Xu G. The therapeutic effect of bone marrow-derived mesenchymal stem cells on osteoarthritis is improved by the activation of the KDM6A/SOX9 signaling pathway caused by exposure to hypoxia. J Cell Physiol. 2020 Oct;235(10):7173-7182. doi: 10.1002/jcp.29615. Epub 2020 Feb 5. PMID: 32020624.
原文鏈接：http://group9-s.ccame.net/32020624/

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