間歇性高低氧培養(yǎng)箱在服務(wù)于睡眠呼吸暫停綜合征研究的應(yīng)用
【BioSpherix間歇性高低氧培養(yǎng)箱】
“我們”服務(wù)于睡眠呼吸暫停綜合征研究
睡眠呼吸暫停綜合征（OSAS），是指睡眠時，由于上呼吸道的狹窄或者塌陷造成的睡眠時呼吸低通氣或者呼吸停頓，長期患病者可以導(dǎo)致高血壓、冠心病、糖尿病等一系列的綜合癥。它分為阻塞型、中樞型和混合型三大類，以阻塞性最多見。
近期北京市的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)鼾癥的患病率為 13.4%。其中隨著年齡增加，患病率不斷上升，61-70 歲的鼾癥患病率達到 23.6%。而睡眠呼吸暫停的患病率為 3.1%。美國有學(xué)者認為 60 歲以上鼾癥的患病率為 50%，美國成人男性睡眠呼吸暫停發(fā)病率為 9%，女性 4%。想想我們身邊的人，五個人中可能就有一個OSA的患者。
睡眠呼吸暫停綜合征的危害是多方面的，對人體的影響也是系統(tǒng)性的：包括心血管系統(tǒng)中高血壓、心律失常等；內(nèi)分泌中胰島素抵抗、糖代謝異常等；誘發(fā)呼吸衰竭、加重哮喘，還可引起難治性的慢性咳嗽、肺動脈高壓、肺栓塞，甚至肺間質(zhì)疾病等。病人表現(xiàn)為注意力下降、認知功能下降，出現(xiàn)焦慮、抑郁等情緒癥狀。
人們對OSAS慢性間歇性缺氧的探索從未中斷，下面我們一起來看兩篇針對此方向的深入研究。
案例一
Delayed Neutrophil Apoptosis in Patients with Sleep Apnea
期刊：American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine(IF=21.405)
摘要：以間歇性缺氧/復(fù)氧（IHR）為特征的阻塞性睡眠呼吸暫停（OSAS）與動脈粥樣硬化相關(guān)。中性粒細胞（PMN）通過在PMN與內(nèi)皮細胞的相互作用中產(chǎn)生氧化自由基和蛋白水解酶參與動脈粥樣硬化的形成。一般來說，缺氧促進細胞凋亡。然而，與其他細胞不同，在中性粒細胞中，缺氧嚴重抑制細胞凋亡。
方法：采用流式細胞術(shù)檢測全血中性粒細胞凋亡和粘附分子的表達，并通過各種培養(yǎng)條件和形態(tài)學(xué)進行驗證。同時，將全血和純化的中性粒細胞暴露于IHR和體外持續(xù)缺氧中。
將全血或純化的中性粒細胞暴露于三到六個周期的間歇性缺氧中�？諝庀嘣O(shè)定值包括35分鐘的缺氧期，然后25分鐘的復(fù)氧（21%O2和5%CO2），使用BioSpherix Oxycler C42系統(tǒng)（BioSpherix，Redfield，NY）。在每個1小時的周期中，實際血氧飽和度分別保持在2%或6%，持續(xù)時間為6.6, 6 ,3.6分鐘或6.55, 6, 2.75分鐘。持續(xù)缺氧（SH）的持續(xù)時間相同（血液中實際含氧量的2%）。對照組治療后的血液在常氧條件下維持相同的時間。浸入血液中的氧電極連續(xù)監(jiān)測溶解氧濃度。
圖1.與常氧相比，間歇性缺氧/復(fù)氧（IHR）和持續(xù)缺氧（SH）對健康受試者多形核白細胞（PMN）凋亡測量的體外影響。（A） 流式細胞術(shù)檢測全血中性粒細胞中粘附分子CD16的低表達。（B） 經(jīng)熒光DNA結(jié)合染料Hoechst 33342染色的純化中性粒細胞的細胞自旋制備的代表性顯微照片，顯示染色質(zhì)凝聚和凋亡小體的明亮熒光。與常氧相比，SH中的熒光較低，IHR處理的PMN中的熒光最低。（C） 經(jīng)May Grunwald Giemsa染色的純化中性粒細胞的細胞自旋制備的典型顯微照片。凋亡的中性粒細胞通過密集的染色質(zhì)凝聚來鑒定，要么是單個核，要么是核碎片。細胞凋亡在常氧狀態(tài)下最高，在IHR狀態(tài)下較低。在IHR治療中，將血樣（A）或純化的中性粒細胞（B、C）暴露于六個周期。每個周期持續(xù)一小時。在缺氧期間，實際血液O2濃度為2%，持續(xù)時間為6.6-3.6分鐘。在常氧期間，血液O2在14.0 6 1.5分鐘內(nèi)恢復(fù)到15%以上。在SH治療中，整個期間實際血液或介質(zhì)O2濃度保持在2%。對照組在常氧條件下（21%O2，5%CO2與N2平衡）維持相同的時間。在所有處理中，二氧化碳保持不變（5%）。
圖2.睡眠呼吸暫停中白細胞在內(nèi)皮細胞損傷中的作用示意圖。在常氧條件下，白細胞在血流中自由流動，內(nèi)皮細胞處于非激活狀態(tài)。然而，粘附分子的基本水平在白細胞和內(nèi)皮細胞表面以低水平表達。
主要結(jié)論：本研究首次證明，在中重度OSAS患者中，PMN凋亡延遲。凋亡的中性粒細胞百分比與OSAS嚴重程度呈負相關(guān)；OSAS中性粒細胞凋亡減少，粘附分子表達增加。雖然粘附分子可能促進PMN與內(nèi)皮細胞相互作用的增加，但凋亡的減少可能進一步增強這些相互作用，促進自由基和蛋白水解酶的釋放；OSAS患者中性粒細胞凋亡減少，粘附分子表達增加。白細胞與延遲的中性粒細胞凋亡共同對OSAS患者的內(nèi)皮細胞構(gòu)成動脈粥樣硬化威脅，可通過鼻持續(xù)氣道正壓通氣有效治療。
案例二
bnormal lipid droplets accumulation induced cognitive deficits in obstructive sleep apnea syndrome mice via JNK/SREBP/ACC pathway but not through PDP1/PDC pathway.
期刊：Molecular Medicine
摘要：慢性間歇性低氧(CIH)導(dǎo)致認知障礙的機制尚不清楚。但在這里，我們的研究發(fā)現(xiàn)，約3個月的CIH治療誘導(dǎo)C57BL/6小鼠海馬神經(jīng)和膠質(zhì)細胞中的脂滴(LDs)積聚，并引起嚴重的神經(jīng)損傷，包括神經(jīng)元損傷、成神經(jīng)細胞(NB)凋亡和異常的膠質(zhì)細胞活化。也就是說OSAS造成的CIH，可引起嚴重的神經(jīng)認知功能障礙，與海馬形態(tài)學(xué)的區(qū)域性改變有關(guān)；脂質(zhì)代謝紊亂導(dǎo)致神經(jīng)和神經(jīng)膠質(zhì)細胞損傷，最終導(dǎo)致行為功能障礙。
方法：SMND-309提取自丹參。給藥后可在大鼠腦中檢測到其為丹酚酸B的新代謝產(chǎn)物.研究證明309通過抗凋亡、抗炎和抗氧化作用促進神經(jīng)元存活。在這項研究中，SMND-309被腹膜內(nèi)注射到小鼠體內(nèi)，以減輕CIH引起的神經(jīng)損傷。這可能有助于開發(fā)潛在的治療OSAS的藥物靶點。
CIH：
小鼠每天從上午8:00到下午4:00暴露在CIH/室內(nèi)空氣(RA)條件下，持續(xù)約3個月。在暴露期間，將WT + CIH組和SMND-309 + CIH (3-FP + CIH)組中的小鼠放入CIH室(BioSpherix OxyClycler A84，美國)，將WT + r A組和SMND-309 (3-FP)組放入RA室(BioSpherix OxyClycler A84，美國)。首先，這個小室充滿了氮氣持續(xù)85-95秒，氧氣水平從21%±1%(正常)降至7%±1%(缺氧)。然后，氧氣水平在15-20秒內(nèi)保持在7%±1%。最后，氧氣水平在45-50秒內(nèi)恢復(fù)到21%±1 %,并持續(xù)15-20秒。CIH循環(huán)持續(xù)約180秒，每小時約20個循環(huán)。RA艙內(nèi)的氧氣水平始終保持在21%±1%。
IH：
通過在安裝在培養(yǎng)箱內(nèi)的氧氣控制柜(Biospherix Oxycycler C42)中培養(yǎng)細胞來誘導(dǎo)IH，該氧氣控制柜配備有用于連續(xù)監(jiān)測氧氣水平的氧氣傳感器。氮氧和5%二氧化碳的混合物輸注，氧水平包括30分鐘的低氧期(3% O2)，隨后是30分鐘的復(fù)氧期(21% O2).實際O2在每個1小時的循環(huán)中，飽和度保持在3% 10分鐘，進行3天。
圖3.SMND-309的研究過程和結(jié)構(gòu)。A.研究工作流程。在7天的適應(yīng)后，小鼠暴露于CIH條件下約3個月，并在最后一周用SMND-309治療。CIH暴露結(jié)束后，立即進行行為測試。B.CIH治療計劃。紅線代表設(shè)定點。藍線代表實際的含氧量。C.SMND-309的結(jié)構(gòu)
圖4.DG區(qū)的病理變化。A.海馬的H&E染色。在WT + CIH組的SGZ中，幾乎沒有觀察到NBs(白色箭頭)，但是SMND-309治療減輕了損傷。原始放大倍數(shù):400倍。B.海馬的透射電鏡結(jié)果。WT + CIH組的神經(jīng)元表現(xiàn)出細胞質(zhì)空泡化、LDs積聚(黑色箭頭)和線粒體破裂(黑色三角形)。此外，WT + CIH組的神經(jīng)膠質(zhì)細胞出現(xiàn)水腫(黑星)，尤其是在血腦屏障周圍區(qū)域。原始放大倍數(shù):15000倍。所有實驗重復(fù)三次。
主要結(jié)論：SMND-309是丹參，已應(yīng)用于神經(jīng)保護，SMND-309治療通過減少DG區(qū)神經(jīng)和神經(jīng)膠質(zhì)細胞中LDs的積累來改善CIH小鼠的行為表現(xiàn)。這些發(fā)現(xiàn)可能有助于提供一種新的潛在的神經(jīng)保護療法。在這項研究中，CIH誘導(dǎo)的海馬損傷是由NBs、神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞中LDs的積累觸發(fā)的。LDs的產(chǎn)生可通過JNK/SREBP/ACC途徑調(diào)節(jié)。SMND-309治療減輕了這些損傷。迄今為止，LDs在神經(jīng)細胞中的作用仍有爭議。脂質(zhì)合成障礙和LDs異常積聚機制仍不清楚。所有這些問題都需要進一步研究。
在對OSAS的研究中，無論是以細胞還是動物為實驗建模對象，都離不開間歇性缺氧這個實驗條件，在兩份研究中，能精準控制中性粒細胞和小鼠缺氧暴露時間與濃度的設(shè)備，都是來自Biospherix的產(chǎn)品：
01 OxyCycler C42高級動態(tài)可編程氧氣控制系統(tǒng)
動態(tài)雙通道/雙氣體控制器�？赏瑫r連接兩個C-chamber,各自獨立編程。
動態(tài)氧氣編程，氧氣設(shè)置0.1-99.9%，二氧化碳設(shè)置0.1-20.0%
外接CO2、N2和O2三個氣瓶，輕松實現(xiàn)急性高氧/缺氧、慢性缺氧和高/低氧交替控制
可同時獨立編程控制兩個腔室的氣體濃度曲線
通過電腦軟件，可預(yù)編程和存儲不同的氣體濃度升降位點、持續(xù)時間以及循環(huán)次數(shù)，實時記錄和存儲氣體濃度等數(shù)據(jù)。
02 OxyCycler A840V動態(tài)編程氧氣控制系統(tǒng)
可動態(tài)設(shè)定氧氣濃度（0.1-99.9%），可同時控制4個動物籠,，獨立運行不同的程序
可以輕松完成程序式低氧/高氧控制
可快速達到氧氣濃度設(shè)定值，并循環(huán)程序1-999次或無限
可選配監(jiān)控器，快速檢測到氣體濃度中斷并及時修正
電腦操作界面，實時記錄探頭反饋數(shù)據(jù)，顯示趨勢圖表
參考文獻：
【1】Dyugovskaya L, Polyakov A, Lavie P, Lavie L. Delayed neutrophil apoptosis in patients with sleep apnea. Am J Respir Crit Care Med. 2008 Mar 1;177(5):544-54. doi: 10.1164/rccm.200705-675OC. Epub 2007 Nov 15. PMID: 18006889.
【2】Li, D., Xu, N., Hou, Y. et al. Abnormal lipid droplets accumulation induced cognitive deficits in obstructive sleep apnea syndrome mice via JNK/SREBP/ACC pathway but not through PDP1/PDC pathway. Mol Med 28, 3 (2022). https://doi.org/10.1186/s10020-021-00427-8
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