使用產(chǎn)色基質(zhì)法檢測細菌內(nèi)毒素含量的實驗步驟

日本學者對內(nèi)毒素的產(chǎn)色基質(zhì)測定法（Chromogenic subs-trate method）進行了大量的研究。從鱟試驗的反應機理可知，鱟試劑中含有一種特異的前凝固酶，其受內(nèi)毒素激活后變成有活性的凝固酶，后者具有α-凝血酶的活性及Xa因子及XⅡa因子的一些功能。這種酶可水解凝固蛋白原成三個片段，即A鏈、B鏈及C肽。A、B鏈和C肽再通過共價相聯(lián)而成為凝膠。此酶作用的部位，分別為A鏈羧基端的-Val-Leu-Gly-Arg（Gly，Arg 分別為第17、18位）及C肽的-Val- Ser-G1y-Arg（G1y，Arg分別為第45、46位）上，提示羧基末端Gly-Arg的結(jié)構(gòu)可受到鱟血凝固酶的作用。鑒于此，利用人工合成的肽-硝基苯胺.（肽一PNA）或肽-4甲基香豆素酰胺（肽-MCA）基質(zhì)中肽段氨基酸排列順序與凝固蛋白質(zhì)切斷部位的氨基酸排列順序相同的特性，就可以由于這種酶的水解作用，使產(chǎn)色基質(zhì)游離出來，即可用分光光度計于適當?shù)牟ㄩL處測得吸光度。

如用肽-PNA基質(zhì)，則釋出的為PNA，可在405nm處測定吸光值。如用肽-MCA基質(zhì)，即釋出7-氨基-4-甲基香豆素（AMC）經(jīng)380nm波長紫外線激發(fā)后，在460nm處可測得熒光，如用370nm波長亦可測知AMC的游離量。

目前應用的產(chǎn)色基質(zhì)有許多種，主要有:
Bz - lle - Glu - Gly -Arg - PNA
Bz - Val - Gly - Arg - PNA
Boc - Lue - Gly - Arg -PNA
Boc - Lue - Gly - Arg - PNA
Boc - Ser - Gly - Arg - PNA
Boc - Leu - Gly -Arg - MCA
Boc - Ser - Gly - Arg- MCA等。

這些基質(zhì)對鱟凝固酶的酰胺酶感性隨內(nèi)毒素濃度的提高和作用時間的延長而增強，顯示其高度的專一性。測出內(nèi)毒素的范圍為5Pg-50ng/ml。反應時間延長測得更低的內(nèi)毒素值。反應需要的最適pH為8.0～8.5。

在試驗時必須作陽性標準管，即以一定濃度（如0.100，0.025，0.075ng/ml）的標準內(nèi)毒素與肽-PNA或肽-MCA反應，然后作出線性標準曲線。作出的標準曲線，其相關(guān)系數(shù)應＞0.98，變異系數(shù)＜5 %。被檢樣品的吸光值只要與標準曲線比較，即得知標本中所含的內(nèi)毒素量。亦可采用下列公式求得如下圖:

如果要測定血漿或血清中的內(nèi)毒素，則由于其中含有內(nèi)毒素抑制蛋白，可事先加熱37℃30分鐘，以破壞這些抑制物質(zhì)，或通過稀釋的方法消去這些抑制物質(zhì)。亦可在血清中加入標準內(nèi)毒素作出標準曲線。