甘草查耳酮A抑制肺癌細胞中干擾素-γ誘導的程序性死亡配體1

近年來，針對程序性死亡配體1（PD-L1）和程序性死亡受體1（PD-1）的抗體免疫療法在肺癌治療中取得了很大進展。PD-1 可以與其配體 PD-L1 相互作用，在腫瘤微環(huán)境中負調(diào)控 T 細胞相關(guān)的免疫反應，導致腫瘤細胞逃避 T 細胞介導的免疫監(jiān)視。先前的研究結(jié)果表明，具有抑制 PD-L1 能力的小分子可能是增強抗腫瘤免疫的關(guān)鍵方法。

PD-L1 表達的調(diào)控涉及多種機制，其中 IFN-γ 誘導的 PD-L1 是多種癌癥類型中 PD-L1 的主要來源。IFN-γ，主要由 CD8⁺ T 細胞和自然殺傷細胞產(chǎn)生，在腫瘤微環(huán)境中是一把雙刃劍。IFN-γ 誘導 PD-L1 表達以抑制細胞毒性T 淋巴細胞的功能并促進多種癌癥類型的腫瘤生長。因此，干擾 IFN-γ 誘導的 PD-L1 的藥物可能具有應用于免疫治療的潛力。

甘草查耳酮A （Licochalcone A ，圖1 A）是一種從豆科植物甘草中提取的查耳酮類化合物。研究表明，LCA 通過增加肺癌細胞中 C/EBP 同源蛋白的表達，誘導細胞凋亡、自噬并降低細胞活力。它還通過誘導多種類型的癌細胞凋亡來發(fā)揮抗癌作用，并通過調(diào)節(jié) PI3K/Akt 通路抑制口腔鱗癌細胞的侵襲和遷移。

以往的研究主要集中在 LCA 對腫瘤細胞的細胞毒性作用，而中藥質(zhì)量研究國家重點實驗室（澳門大學）、中國藥科大學天然藥物國家重點實驗室的研究團隊曾旨在證明 LCA 的另一種潛在的抗癌機制，即通過下調(diào) IFN-γ 誘導的 PD-L1 表達來逆轉(zhuǎn)癌細胞的免疫逃逸。
 

LCA 對肺癌細胞中 IFN-γ 誘導的 PD-L1 蛋白表達的影響

首先，人肺癌 A549 細胞系用 5、10、15 和 20 μM LCA 與或不與 IFN-γ（5 ng/ml）處理 24 小時，使用蛋白質(zhì)印跡法測定 PD-L1 蛋白表達。如圖1 B，IFN-γ 誘導 PD-L1 多條帶表達，這可能是由于 PD-L1 的糖基化。10、15 和 20 μM LCA 在 A549 細胞中抑制 IFN-γ 觸發(fā)的 PD-L1 表達，而 5 μM LCA 引起 IFN-γ 誘導的 PD-L1 的條帶偏移，可能是因為 5 μM LCA 部分干擾了 PD- L1 表達并進一步影響 PD-L1 糖基化。

接下來選擇 10 μM LCA 進行進一步研究。用 10 μM LCA 預處理細胞 1 小時，然后用 5 ng/ml IFN-γ 處理 0.5、3、6、12、24 小時。如圖1 C，10 μM LCA 在 6h-24h 內(nèi)在 A549 細胞中抑制 IFN-γ 誘導的 PD-L1 表達。

為了進一步證實 LCA 對 IFN-γ 誘導的 PD-L1 表達的影響，實驗研究了另外兩種肺癌細胞系NCI-H1299 和 NCI-H1650。如圖1 F-I ，10 μM LCA 還消除了 NCI-H1299 和 NCI-H1650 細胞中 IFN-γ 誘導的表達。這些結(jié)果表明，10 μM LCA 可抑制 IFN-γ 觸發(fā)的肺癌細胞中 PD-L1 膜定位。
 

圖1 LCA 對 IFN-γ 誘導的肺癌細胞 PD-L1 蛋白表達的影響。

LCA 對 Jurkat T 細胞在共培養(yǎng)系統(tǒng)中增殖和存活的影響

為了確定 PD-L1 表達的生理相關(guān)性，使用共培養(yǎng)系統(tǒng)評估 A549 細胞 PD-L1 水平對 Jurkat T（人急性T細胞白血病細胞 ）細胞功能的影響（圖2 A ）。首先測量了共培養(yǎng)系統(tǒng)中 Jurkat T 細胞的增殖。與對照組相比，IFN-γ（5 ng/ml）處理組的 Jurkat T 細胞增殖受到抑制，而這種增殖抑制作用在 10 μM LCA 存在時恢復，1 μM RUXO 處理則部分逆轉(zhuǎn)（圖2 B、C）。

接下來，在共培養(yǎng)系統(tǒng)中分析 Jurkat T 細胞的凋亡。在圖2 D、E 中，位于 Q2 和 Q3 上的細胞被認為是凋亡細胞。與對照組（2.18% ± 0.25%）相比，5 ng/ml IFN-γ 處理的 A549 細胞增加了 Jurkat T 細胞的凋亡率（17.34% ± 4.65%）。此外，在 10 μM LCA 或 1 μM RUXO 存在下，IFN-γ 處理的 A549 細胞對 Jurkat T 細胞的促凋亡作用受到抑制。結(jié)果表明，10 μM LCA 可減少共培養(yǎng)系統(tǒng)中的 Jurkat T 細胞凋亡。
 

圖2 LCA 對 Jurkat T 細胞在共培養(yǎng)系統(tǒng)中增殖和存活的影響。（A）共培養(yǎng)系統(tǒng)的程序。（B、C）共培養(yǎng) 48 小時后，測量Jurkat 細胞增殖的平均熒光強度（MFI）。RUXO：魯索替尼。（D、E）在 24 小時共培養(yǎng)后評估凋亡的 Jurkat 細胞。

LCA 對蛋白質(zhì)合成的影響

由于 GSK3β 等多種因素介導 PD-L1蛋白降解，LCA 可能通過蛋白降解途徑下調(diào) IFN-γ 誘導的 PD-L1。如圖3 B，蛋白酶體抑制劑 MG-132 和溶酶體抑制劑氯喹（CQ）均未能逆轉(zhuǎn) 10 μM LCA 介導的 IFN-γ（5 ng/ml）引發(fā)的 A549 細胞中 PD-L1 表達的降低。

基于上述結(jié)果，LCA 可能通過抑制蛋白質(zhì)合成來消除 IFN-γ 觸發(fā)的 PD-L1 表達。在此，順鉑CIS（20 μM）和蛋白質(zhì)合成抑制劑 CHX（50 μM）分別用作陰性和陽性對照（圖3 C）。與 CHX 類似，用 10 μM LCA 處理可以抑制蛋白質(zhì)合成。

蛋白質(zhì)翻譯分為兩種類型，即帽依賴性翻譯和非帽依賴性翻譯。帽依賴性翻譯是一種真核翻譯，它依賴于 eIF4e 與 5' 帽的結(jié)合來啟動 mRNA 翻譯，而非帽依賴性翻譯不需要 5' 帽，而是需要內(nèi)部核糖體進入位點（IRES）來啟動翻譯。為了確認抑制蛋白質(zhì)合成的結(jié)果，引入了海腎螢光素酶-IRES-螢火蟲螢光素酶（RLUC-IRES-FLUC）質(zhì)粒（圖3 D）。與對照組相比，RLUC 和 FLUC 強度的倍數(shù)變化分別代表帽依賴性和非帽依賴性翻譯。正如預期的那樣，10 μM LCA 處理將 RLUC 強度和 FLUC 強度降低了約 40%（圖3 E），表明 10 μM LCA 抑制帽依賴性和非帽依賴性翻譯。
 

圖3 LCA 對蛋白質(zhì)合成的影響。

LCA 對 ROS 生成的影響

據(jù)報道，ROS 會抑制蛋白質(zhì)合成。LCA 是否通過產(chǎn)生 ROS 來消除 IFN-γ 誘導的 PD-L1 有待進一步研究。

首先將 10 μM LCA 分別在 0.25、1、3、6、12 h 點作用于 A549 細胞，結(jié)果表明，10 μM LCA 在 A549 細胞中以時間依賴性方式誘導 ROS 生成。H2O2（處理0.25 h）為陽性對照（圖4 A、B）。

然后，在 A549 細胞12 小時的時間點，將抗氧化劑 NAC（5 mM 和 10 mM）與或不與 10 μM LCA 聯(lián)合預處理 1 小時，然后用 5 ng/ml IFN-γ 處理 12 小時。如圖4 C、D，IFN-γ 單組對 ROS 生成無顯著影響，而 10 μM LCA 和 LCA 加 IFN-γ 均顯著誘導 ROS 生成。此外，5 mM 和 10 mM NAC 使 10 μM LCA 誘導的 ROS 生成的 MFI 分別降低了約 45% 和 65%。更重要的是，NAC 還部分逆轉(zhuǎn)了 A549 細胞中 12 小時點的 PD-L1 膜定位（圖4 E、F）。基于上述結(jié)果，LCA 可能通過 ROS 產(chǎn)生消除了 IFN-γ 誘導的 PD-L1 翻譯。
 

圖4 LCA 對 ROS 生成的影響。

圖5 圖形概要
 

LCA 在人肺癌細胞中下調(diào) IFN-γ 誘導的 PD-L1蛋白表達和膜定位，無論是否抑制 PD-L1 mRNA 水平或促進其蛋白降解。LCA 降低了共培養(yǎng)系統(tǒng)中 A549 細胞中由 IFN-γ 誘導的 PD-L1 表達引起的 Jurkat T 細胞的凋亡和增殖抑制。引人注目的是，LCA 被證實是一種蛋白質(zhì)合成抑制劑，它降低了帽依賴性和非帽依賴性翻譯。LCA 抑制 PD-L1 翻譯，可能是由于 4EBP1 磷酸化（Ser 65）的抑制和 PERK-eIF2α 通路的激活。此外，LCA 在肺癌細胞中以時間依賴性方式誘導 ROS 生成。NAC 不僅抑制由 LCA 觸發(fā)的 ROS 生成，而且還恢復了 IFN-γ 誘導的 PD-L1 表達。通過與 NAC 共處理，LCA 觸發(fā)的 4EBP1 磷酸化（Ser 65）抑制和 PERK-eIF2α 軸的激活均得到恢復。

該研究首次發(fā)現(xiàn) LCA 通過翻譯抑制作用消除 IFN-γ 誘導的 PD-L1，為 LCA 在癌癥免疫治療中的應用提供了新的思路。LCA 對翻譯過程的確切靶點以及 LCA 對抗腫瘤免疫反應的體內(nèi)生物學作用有待進一步研究。

參考文獻：Yuan LW, Jiang XM, Xu YL, Huang MY, Chen YC, Yu WB, Su MX, Ye ZH, Chen X, Wang Y, Lu JJ. Licochalcone A inhibits interferon-gamma-induced programmed death-ligand 1 in lung cancer cells. Phytomedicine. 2021 Jan;80:153394. doi: 10.1016/j.phymed.2020.153394. Epub 2020 Oct 22. PMID: 33130472.
原文鏈接：https://pubmed-ncbi-nlm-nih-gov.proxy.library.carleton.ca/33130472/

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