Scale-X™ 生物反應器的種子擴增強化

Scale-X™生物反應器的種子擴增強化
優(yōu)化種子培養(yǎng)策略，更快，更低成本的擴大, 實現(xiàn)細胞收獲

應用筆記
Thomas Robert¹, Jean-Christophe Drugmand¹, Antoine Hubert¹, Tania Pereira Chilima¹
1 Univercells Technologies

簡介
長期以來，貼壁細胞培養(yǎng)平臺的使用一直被視為生產疫苗和基因療法的金標準。在上市速度是關鍵的領域，這些技術相對容易采用的優(yōu)勢可以帶來顯著的好處。然而，使用塑料培養(yǎng)容器等傳統(tǒng)貼壁技術缺乏可放大性，使其成為晚期臨床或商業(yè)規(guī)模生產成本高昂的選擇⁽¹⁾。

固定床生物反應器可以為基于貼壁細胞培養(yǎng)的病毒生產提供可放大且強化的替代方案，從而應對上述挑戰(zhàn)。scale-X™ 結構化卷膜固定床生物反應器有多種尺寸可供選擇，包括 scale-X hydro、carbo和nitro型號（可用于細胞生長的表面積分別為 2.4 m²、10-30 m²和200-600 m²）支持產品開發(fā)、臨床和商業(yè)化生產⁽²⁾。scale-X 生物反應器的設計范圍旨在不同規(guī)模條件下保持相同的微環(huán)境，其已被證明可以顯著提高各種細胞病毒產品的細胞密度和特異性生產率^(3-6)。Univercells Technologies 最大的生物反應器 scale-X nitro 200 和 600 型號在 NevoLine™ Upstream 平臺內運行，該平臺集成了上游和中游工藝步驟，從而提供了減少占地面積和端到端自動化的額外好處 ⁽⁷⁾。

雖然與病毒生產強化相關的好處是顯著的，但它們并沒有消除與大規(guī)模貼壁工藝相關的關鍵瓶頸：種子擴增。為 scale-X nitro 600 等生物反應器生產必要的細胞接種液需要多個擴增步驟，通常在塑料培養(yǎng)容器中進行（圖 1），這會產生巨大的成本并增加操作次數(shù)，從而與操作員相關的錯誤的可能性更高。認識到這一關鍵挑戰(zhàn)，Univercells Technologies 設計了一種解決方案，其能夠通過酶和機械作用的組合從 scale-X 固定床收獲細胞，其原理與當前基于塑料培養(yǎng)容器的方法相似。機械作用是通過一種符合 GMP 的新型細胞收獲模塊提供的，該模塊設計與 scale-X carbo 系統(tǒng)集成（圖 2）。這將有效地使 scale-X carbo生物反應器能夠用作大規(guī)模貼壁細胞工藝的種子擴增培養(yǎng)強化解決方案。

本應用筆記將詳細介紹利用 scale-X carbo生物反應器作為 scale-X nitro生物反應器種子培養(yǎng)強化解決方案的可行性。為此，使用 scale-X hydro (2.4 m²) 測試了細胞分離方案，并放大到 carbo 10 和 30 生物反應器。實驗研究了從固定床分離貼壁細胞的能力，以及收獲細胞的活性及其分離后的生長曲線和表型。實驗結果與詳細的成本模型相結合，以評估種子擴增培養(yǎng)強化的經(jīng)濟影響。
  上圖描述了使用塑料培養(yǎng)容器（T 瓶和多層容器）制備 600 m² 固定床生物反應器接種液所需的連續(xù)步驟。假設：1）塑料培養(yǎng)容器的接種密度為 3x104，大規(guī)模 nitro 600 生物反應器的接種密度為 1x104，2）塑料培養(yǎng)容器的收獲產量為 2x105 cells/cm²，3）每個多層容器 (MT) 表面積為632 cm²。
  scale-X carbo收獲模塊的概念示意圖。左：scale-X carbo 控制器（用于 GMP 和非 GMP 細胞培養(yǎng)的商業(yè)化產品）。右圖：概念細胞收獲模塊（*現(xiàn)在的前端開發(fā)）。
 
 
材料和方法

細胞培養(yǎng)材料和條件

來自凍存細胞庫（18H003，ECACC）的貼壁HEK293 細胞用于所有實驗。在添加有 5% 胎牛血清的DMEM（4.5 g/L 葡萄糖）中進行 T 瓶、多層培養(yǎng)容器和生物反應器培養(yǎng)。在生物反應器中進行細胞培養(yǎng)之前，將細胞在 T 瓶和多層容器中預培養(yǎng)達到所需的接種液。每3至4天進行一次傳代。

生物反應器培養(yǎng)

在表 1 中詳述的條件下，將細胞接種在 scale-X hydro、carbo 10 和 30 生物反應器中，在開始細胞生長期之前，這些反應器以批次模式保持 4 小時，以促進細胞粘附。培養(yǎng)基和固定床采樣載體的每日樣品分別通過葡萄糖和乳酸測量以及直接細胞計數(shù)用于評估細胞生長。
   
細胞收獲模塊

在本研究中，目前正在申請專利的開發(fā)中專用收獲模塊的原型被用于促進酶孵育后的細胞分離。收獲模塊由一個連接到平臺生物反應器以產生機械作用（低振幅和高頻振動）的裝置組成（圖 2）。

生物反應器的細胞收獲液

在擴增 4 到 6 天后，從生物反應器中進行收獲。在收獲之前，清空生物反應器并用 37°C 預熱的、含有 5 mM EDTA 的 DPBS 溶液 (DPBS-EDTA) 沖洗 2-5 次（取決于生物反應器型號）。隨后，將 37°C 預熱的分離溶液添加到生物反應器中，然后在攪拌（固定床內的線速度為 0.5 cm/s）和溫度控制（37°C）條件下孵育 20-25 min。對于本研究，使用 Accumax™ 酶溶液（Innovative Cell Technologies），1X或在 DPBS-EDTA 中1:3 稀釋。在酶孵育后，生物反應器移至收獲模塊進行振動處理，同時容器排液。在某些情況下，在第一次收獲之后，用酶溶液進行多次沖洗。在所有情況下，收獲后，生物反應器用 DPBS-EDTA 沖洗 1-5 次。在一些或所有沖洗步驟期間施加振動。在收獲過程的各個步驟中采集固定床載體和上清液樣品，以確定收獲效率和細胞活性。細胞收獲方案的概況如圖 3 所示。

細胞數(shù)量檢測

使用血細胞計數(shù)器通過臺盼藍染料排除法測量收獲細胞中的細胞密度和活性。通過細胞裂解（scale-X 細胞計數(shù)試劑盒，Univercells Technologies）并進行結晶紫染色和用血細胞計數(shù)器計數(shù)細胞核，進行采樣載體的生物量評估。固定床纖維上的細胞核計數(shù)用于估計生物反應器內的總細胞數(shù)。細胞收獲后，拆解生物反應器，從代表性位置取出固定床的一部分，以評估固定床上剩余的細胞密度。

再接種實驗

從所有生物反應器收獲的細胞接種在 T 瓶中，以評估第一次傳代時的再接種效率、細胞形態(tài)、活性和細胞回收。與從塑料培養(yǎng)容器中收獲的對照細胞相比，評估了種群倍增時間 (PDT值) 和細胞形態(tài)。此外，從一個hydro (#5) 和一個carbo 10 (#2) 生物反應器中收獲的細胞被用于接種新的hydro生物反應器，以為“固定床到固定床”接種提供概念驗證。使用固定床收獲細胞的接種條件如前所述。

成本建模

為了評估種子擴增強化的經(jīng)濟影響，使用 BioSolve Process 軟件（Biopharm Services Limited，英國）進行了成本估算。該模型旨在比較兩種情況：僅使用塑料培養(yǎng)瓶和多層細胞堆棧的傳統(tǒng)種子擴增鏈（如圖 1 所示），或通過一個 scale-X carbo 30 生物反應器步驟替換最后兩個擴增步驟的等效工藝。該模型使用以下主要假設：

1. 600 m² 生物反應器的目標接種液為1x104 cells/cm²（總共 600 億細胞）；
2. 所有培養(yǎng)瓶和多層容器的接種密度為 3x104cells/cm²，scale-X carbo 30 生物反應器的接種密度為 1x104 cells/cm²；
3. 所有培養(yǎng)瓶和多層容器步驟在B級潔凈室進行細胞培養(yǎng)；
4. 所有生物反應器步驟在C級潔凈室進行細胞培養(yǎng)；
5. 對于培養(yǎng)容器和 scale-X carbo生物反應器，收獲細胞產量為 2x105 cells/cm²。
 
假設每年 25 個批次，按批次或每年計算產出。
  細胞在 scale-X 生物反應器中擴增 4-6 天 (1)。在收獲當天，沖洗生物反應器 (2)，然后用酶溶液充滿并孵育 20-25 min (3)。隨后，將生物反應器轉移到收獲模塊，同時施加振動和排液(4)。最后，進行沖洗，以進行細胞回收 (5)。步驟 1-3 使用安裝在 scale-X hydro/carbo控制器上的生物反應器進行。對于步驟 4-5，這些生物反應器轉移到收獲模塊。
 
 
結果

細胞收獲效率

本文中描述的所有實驗均使用未稀釋或 1:3稀釋的 Accumax 進行，因為初步研究已確定與 TryPLE 相比，其性能有所提高（數(shù)據(jù)未顯示）。用 Accumax 孵育之后進行收獲步驟以及隨后的多個沖洗步驟。對不同收獲方法的評估表明，一個收獲循環(huán)后至少 2 個沖洗循環(huán)，同時結合收獲模塊的振動，在回收細胞方面最有效（數(shù)據(jù)未顯示）。在所有實驗中，對收獲前后采樣載體的分析表明，>90% 的細胞從固定床基質中分離出來（表 2）�？偟膩碚f，可以從 scale-X hydro生物反應器中以單細胞懸液的形式收獲 2.7 到 5.1x109 細胞。此外，可以在對數(shù)期中期（2-3x105cells/cm²）以及接近融合期（4-5x105 cells/cm²）從生物反應器中收獲細胞，這表明在收獲時優(yōu)化細胞數(shù)量對于實現(xiàn)最高的收獲產量至關重要。塑料培養(yǎng)容器中的細胞收獲通常以 2x105 cells/cm² 的細胞密度進行，這突顯了固定床生物反應器能夠以更高密度收獲細胞的優(yōu)勢。

規(guī)模放大至carbo 10 和 30 生物反應器

在hydro規(guī)模的概念驗證和優(yōu)化之后，進行了額外的細胞收獲實驗，以研究收獲性能的可放大性以及 scale-X carbo 10 (n=2) 和 30 (n=1) 規(guī)模。在所有3次收獲中，> 98% 的細胞從固定床基質中分離出來。此外，從 scale-X carbo 30 中以單細胞懸液的形式收獲了多達 5.2x1010細胞（表 2），因此提供了足夠的細胞，可以 8.6x10³ cells/cm²接種 scale-X nitro 600。此外，在hydro規(guī)模下可以觀察到高達 2.1x109 cells/m² 的細胞產量，如果將其轉移至carbo 30，則可能以 1x104 cells/cm² 的密度接種 nitro 600。  
細胞活性和再接種

在本研究進行的所有實驗中，收獲的細胞都表現(xiàn)出高活性（84% 到 96% 之間）（表 2）。用從每個生物反應器收獲的細胞進行再接種實驗。這些實驗是成功的，因為實現(xiàn)了 29-37 小時的 PDT（與 T 瓶傳代對照細胞的29-39 小時相比）（圖 4）。此外，從 scale-X hydro中收獲的細胞（表 2 中的 Hydro #4）也用于接種第二個 Hydro（表 2 中的 Hydro #5），其中觀察到了目標細胞生長（圖 4）。然后從第二個hydro中收獲細胞，為“固定床到固定床”接種提供概念驗證。這一概念也在carbo規(guī)模（第二個carbo運行）中得到驗證，其中carbo生物反應器使用從hydro生物反應器（未顯示）收獲的細胞進行接種。

由于這些固定床到固定床傳代旨在研究用于接種 scale-X nitro 600 生物反應器的條件，因此評估了收獲的細胞懸液中的殘留酶濃度和細胞聚集。即使在沒有額外的漂洗或濃縮步驟的情況下，這些參數(shù)也足夠低，不會干擾細胞從另一個固定床收獲后附著在固定床上的能力。 A)從所有生物反應器運行中收獲的細胞被重新接種在 T 瓶中，用于生長曲線和形態(tài)評估。顯示了從固定床生物反應器收獲的細胞（左）以及從 T 瓶中收獲的對照細胞（右）在重新接種后第 3 天的顯微照片。B）從一個scale-X hydro生物反應器（#4）收獲的細胞用于接種第二個hydro生物反應器（#5）。圖中顯示了兩次連續(xù)運行中細胞密度（左軸）和代謝物乳酸和葡萄糖濃度（右軸）的變化趨勢。箭頭表示收獲和重新接種到第二個生物反應器的時間。
 
用于大規(guī)模貼壁生產的種子擴增鏈的工藝經(jīng)濟性

研究進行了工藝經(jīng)濟性分析，以評估用于 scale-X nitro 600 生物反應器的種子培養(yǎng)強化的經(jīng)濟效益。該模型旨在對僅使用培養(yǎng)瓶和多層細胞堆棧的種子擴增鏈與通過一個 scale-X carbo 30 生物反應器步驟替換最后兩個擴增步驟的等效工藝進行比較。

如圖 5 所示，結果表明，當使用 scale-X carbo 30 生物反應器替換多層培養(yǎng)容器步驟時，主要成本驅動類別顯著節(jié)省。與工廠、勞動力和材料成本相關的節(jié)省分別達到 21%、32% 和 40%。此外，與傳統(tǒng)的多層容器相比，使用 scale-X carbo生物反應器還可以將種子擴增步驟的數(shù)量減少 1 個（5 步 vs. 塑料培養(yǎng)容器的 6 步），同時降低無菌風險并提高過程控制。

上述優(yōu)勢的一個關鍵因素在于，scale-X 生物反應器可以使用較低的接種密度（1x104 cells/cm² vs. 多層容器的3x104 cells/cm²）進行接種。此外，使用封閉的自動化系統(tǒng)可以在 C 級房間中進行操作，從而將 B 級區(qū)域所需的面積減少 41%（未顯示）�？偠�言之，這些結果突顯了與大規(guī)模貼壁生物反應器的種子擴增制備自動化相關的顯著經(jīng)濟效益。
  對使用塑料培養(yǎng)容器和使用 scale-X carbo 30、以 1x104 cells/cm²接種 600 m² 固定床生物反應器的工藝進行了比較，計算了整體成本估算。結果僅包括種子擴增階段的成本。本研究未涵蓋連續(xù)單元操作的成本。使用的關鍵假設在材料和方法部分中有詳細說明。
 
 
討論和總結

本文詳細介紹了評估使用 scale-X 生物反應器進行種子擴增強化的可行性和可放大性的一系列實驗。該研究表明，在多個生物反應器規(guī)模（從 scale-X hydro 到 carbo 10 和 carbo 30）成功地實現(xiàn)了 >90% 的分離效率。收獲方法遵循塑料培養(yǎng)容器的既定工藝，先進行酶處理，然后通過機械作用，促進細胞分離。這項研究的成功歸功于技術設計本身，因為 scale-X 生物反應器提供了結構化固定床設計，有助于分離后的細胞收獲，同時仍保持高壓實度（每單位體積的表面積）以實現(xiàn)高細胞密度。此外，這種結構化的固定床設計在從hydro到carbo規(guī)模的放大研究中也發(fā)揮了重要作用，因為它能夠跨規(guī)模維持相同的微環(huán)境。

收獲的細胞也顯示出了 > 90% 的活性，并且在再接種實驗中，它們的生長動力學與對照條件相當，即使接種在另一個固定床生物反應器中時，這表明在固定床中時，細胞經(jīng)歷與在塑料容器中相似的微環(huán)境，而又受益于生物反應器可以提供的額外過程控制（pH、DO 和溫度）。數(shù)據(jù)表明，從單個scale-X carbo 30 收獲細胞可以產生所需的接種液，以 1x104 cells/cm²接種大規(guī)模固定床生物反應器，例如 scale-X nitro 600。

雖然收獲方案在本研究測試的條件下是有效的，但可能需要針對特定工藝的優(yōu)化，以達到各種配置中所需的接種要求（而各種細胞特性、類型不一，這數(shù)據(jù)只能供參考）。需要優(yōu)化的參數(shù)可能包括振動的頻率和/或持續(xù)時間、酶類型、濃度和孵育時間，或沖洗步驟的數(shù)量。我們預計，基于這種優(yōu)化，目前的細胞收獲解決方案可能與廣泛的應用兼容。

成本建模研究突顯了使用 scale-X 生物反應器實現(xiàn)種子擴增自動化所帶來的顯著節(jié)省。該模型強調了工廠、材料和勞動力成本的降低。此外，在最后的種子培養(yǎng)步驟中實施 scale-X carbo生物反應器可以通過使用封閉的自動化生物反應器降低無菌風險，從而降低這一關鍵工藝的風險。除了成本和風險之外，使用 scale-X carbo生物反應器強化種子培養(yǎng)還將減少液體和固體廢物。

本研究是使用目前正在申請專利的開發(fā)中專用收獲模塊的原型進行的。這個新的附加模塊設計用于在 scale-X carbo控制系統(tǒng)中完全集成，提供有助于符合 GMP 要求的自動化和可追溯性水平。與這種新型系統(tǒng)兼容的專用一次性耗材將實現(xiàn)具有成本效益的細胞擴增和收獲。本應用筆記中顯示的數(shù)據(jù)展示了這種新型收獲模塊如何應對用于病毒生產的種子培養(yǎng)中重大挑戰(zhàn)。
 
 
參考文獻：

1. R. Baghirzade, Adherent versus suspension based platforms: what is the near future of viral vector manufacturing? Cell Gene Ther. Insights. 7, 1365–1371 (2021).
2. T. Pereira Chilima, Innovative fixed-bed bioreactors unify adherent & suspension processing. Univercells Technol. (2021).
3. D. M. Berrie, R. C. Waters, C. Montoya, A. Chatel, E. M. Vela,Development of a high-yield live-virus vaccine production platform using a novel fixed-bed bioreactor. Vaccine. 38, 3639–3645 (2020).
4. A. Chatel, Y. Ghislain, P. Puri, T. Zijdemans, “Scalable Rubella production in scale-X™ bioreactor with MRC-5 cells: Process optimization and scale-up from static flask to scale-X bioreactor with 30 m2 cell growth surface” (2021).
5. R. Carvalho, T. P. Chilima, C. Meeüs, E. Gateau, M. Ferraiuolo, A. Noto, “Suspension-based viral vector production in scale-™ fixed-bed bioreactor Shake flask process transferred in a scale-X hydro fixed-bed bioreactor for Adenovirus production with HEK293 cells adapted to suspension.” (2021).
6. J.-C. Drugmand, A. Chatel, J. Castillo, Y. Dohogne, M. Gras, F. Collignon, S. Kumano, H. Shiomi, scale-X™ bioreactor for viral vector production: Proof of concept for scalable HEK293 cell growth and adenovirus production, (2020)
7. Univercells Technologies, The NevoLine™ Upstream platform -Intensified an automated virus manufacturing (2022), (available at https://www.univercellstech.com/products/nevolineupstream/).
 
 
scale-X™ carbo固定床生物反應器