生物反應(yīng)器在生物工程肝臟器官體外培養(yǎng)研究中的應(yīng)用

急性和慢性肝功能衰竭肝臟移植是唯一治療方法，供體器官卻面臨持續(xù)短缺的情況。器官生物工程技術(shù)有希望利用生物反應(yīng)器體外培養(yǎng)制造人體器官來解決這一困境。然而，該技術(shù)在臨床上的應(yīng)用目前還受到功能血管網(wǎng)絡(luò)重建、特定功能細(xì)胞移植、細(xì)胞系培養(yǎng)條件不同等重重阻礙。
 

Functional characterization of a bioengineered liver after heterotopic implantation in pigs報告了一種將HUVECs（人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞）重新內(nèi)皮化后，原代豬肝細(xì)胞植入生物工程肝臟（BEL）支架，利用生物反應(yīng)器進(jìn)行體外培養(yǎng)增殖器官細(xì)胞獲得生物工程肝臟的方法。

去細(xì)胞支架制備

首先，使用Triton X-100和SDS洗滌劑溶液分別灌注豬肝臟以獲得無細(xì)胞支架。組織學(xué)染色驗證去細(xì)胞化支架中完全去除細(xì)胞物質(zhì)并只保留細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）蛋白膠原I和膠原IV。隨即將去細(xì)胞化的肝臟安裝在生物反應(yīng)器中，并用不含抗生素的內(nèi)皮培養(yǎng)基灌注72小時（37°C，5%二氧化碳）。
 

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)與支架接種

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞同樣在不含抗生素內(nèi)皮細(xì)胞生長培養(yǎng)基中進(jìn)行預(yù)處理（37°C，5%二氧化碳），隨即接種進(jìn)行培養(yǎng)。首先靜態(tài)培養(yǎng)1小時，使得細(xì)胞先附著在支架上，隨后灌注補(bǔ)充含青霉素和鏈霉素的培養(yǎng)基。每天更換培養(yǎng)基，確保生物反應(yīng)器內(nèi)葡萄糖水平在24小時內(nèi)保持在0.3 g/L以上。培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基灌注壓力保持在12 mmHg。

豬肝細(xì)胞分離、培養(yǎng)與支架接種

新鮮豬肝臟去除殘留血液和經(jīng)缺血性損傷預(yù)防性處理后，使用膠原酶和中性蛋白酶進(jìn)行酶解。使用含10% FBS（胎牛血清）的Williams E溶液進(jìn)行細(xì)胞分散，經(jīng)過篩分離、離心富集得到肝細(xì)胞，并在2L培養(yǎng)基中進(jìn)行高密度培養(yǎng)（1X10⁶細(xì)胞/mL）。HUVEC接種至支架的13-16天后，以50 mL/min的速率利用蠕動泵將含有肝細(xì)胞的培養(yǎng)基灌注至反應(yīng)器內(nèi)。接種48h后，觀察到肝細(xì)胞在支架上呈簇狀分布。

反應(yīng)器培養(yǎng)細(xì)胞代謝物與分泌因子分析

每天收集來自生物反應(yīng)器的培養(yǎng)基樣品，進(jìn)行離線分析確定培養(yǎng)基中葡萄糖，氨和乳酸脫氫酶活性的水平。測量葡萄糖濃度用于計算24小時內(nèi)的消耗。使用ELISA試劑盒定量可溶性和白蛋白。
 

經(jīng)組織學(xué)分析、氨清除動力學(xué)分析和尿素生產(chǎn)測定后，證實培養(yǎng)所得到的生物工程肝臟能夠產(chǎn)生白蛋白、氨解毒和尿素合成，具有肝臟器官類似的功能。實驗證實了肝細(xì)胞高密度培養(yǎng)的可行性，并在去細(xì)胞化肝支架中可以保持其器官功能。此外，數(shù)據(jù)顯示在支架中培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞在體外不會阻礙支架中肝細(xì)胞的功能。

生物工程肝臟還可以用于減緩手術(shù)誘導(dǎo)的急性肝功能衰竭模型中氨的積累。該研究結(jié)果證實了設(shè)計生產(chǎn)臨床規(guī)模BEL可行性，并建立了一個優(yōu)化肝臟特異性細(xì)胞接種和植入的生物培養(yǎng)平臺。

參考文獻(xiàn)：

1. Anderson, B.D., Nelson, E.D., Joo, D. et al. Functional characterization of a bioengineered liver after heterotopic implantation in pigs. Commun Biol 4, 1157 (2021). https://doi.org/10.1038/s42003-021-02665-2