抗體的類型、結構及抗體藥物從發(fā)現到進入臨床應用的發(fā)展歷程

抗體的發(fā)現

抗體藥物是生物技術制藥領域的一個重要方面�？贵w藥物的發(fā)展并不是一蹴而就的，抗體的發(fā)現以及抗體藥物的臨床應用經歷了一段漫長的歷史進程。

 

抗體治療的最早應用可以追溯到中國人接種“人痘”預防天花的記載算起，國際上一般公認的人痘接種術最早起源于中國公元１０世紀，但據中國的一些史書記載，種痘始于唐朝。１６６１年，隨著因得過天花而繼承皇位的康熙執(zhí)政，人痘接種開始從民間走進皇宮，種痘術開始在全國得以提倡和推廣。到后來的英國人Jenner受到中國人痘接種法的啟示，接種牛痘預防天花，直至今日，免疫學的發(fā)展已有三個半世紀。

 

早在19世紀末，抗體被動免疫療法的創(chuàng)立為當時不發(fā)達的疾病治療開辟了新途徑。Ehrlich提出的側鏈學說為免疫學與免疫療法奠定了基礎。19世紀80年代后期，學者們在研究病原菌的過程中，發(fā)現白喉桿菌分泌的白喉外毒素有致病性，進而發(fā)現在感染者的血清中有“殺菌素”(bactericidins)，這就是最早發(fā)現的抗體。

 

在抗體發(fā)現早期，這種特異性的抗體物質勾起了科學家們極大的興趣，科學家們前赴后繼致力于解析抗體的結構，但由于落后的實驗條件，進展緩慢。

 

1937年瑞典物理學家Arne Wilhelm Kaurin Tiselius通過電泳技術證明了抗體也是一種蛋白質，并將其稱為γ球蛋白。

 

1953年英國生物化學家Frederick Sanger成功解析了同樣身為蛋白質的胰島素的化學結構，從而為科學家們解析抗體結構指明了方向。1963年，Edelman與RodneyRobert Porter(Sanger的第一個博士研究生)結合兩人多年的研究結果，提出了比較成熟的“Y”型對稱結構的抗體分子模型。

 

1969年，Edelman和Porter完成了一項在當時了不起的成就，他們成功對抗體1300多個氨基酸序列進行了測定，是當時測定氨基酸序列的最大的蛋白質分子。

 

在Edelman提出的抗體多樣性理論的基礎上，1976年，日本科學家利根川進和同事在檢測不產生抗體的胚胎細胞和產生抗體骨髓瘤細胞中抗體輕鏈基因的分布時發(fā)現，胚胎細胞中不同抗體基因距離較遠，而骨髓瘤細胞中抗體基因距離接近，這個發(fā)現說明生殖細胞在發(fā)育成免疫細胞的過程中，抗體基因發(fā)生了重新分布現象。利根川進在此基礎上用一系列確鑿的實驗數據確定了抗體多樣性是由B淋巴細胞中抗體基岡的染色體重排和突變造成的。根據估算，抗體基因通過重組和突變甚至可以編碼100億種不同的抗體，很好解釋了抗體多樣性產生的原因。1987年，利根川進由于抗體多樣性的突破性研究獨享了該年度的諾貝爾生理學或醫(yī)學獎。

 

抗體的類型

抗體重鏈類型直接決定了抗體的類型，哺乳動物抗體重鏈可分為五類，分別以希臘字母γ、α、μ、δ、和ε表示，據此將抗體相應地分為IgG、 IgA、 IgM、IgD和IgE。α和γ大約含有450個氨基酸，μ和ε約含550個氨基酸；同時μ鏈和ε鏈含有5個肽環(huán)，γ鏈、α鏈、δ鏈含有4個肽環(huán)。

 

IgG是血清中一種主要的Ig，含量占總Ig的65—75%左右。廣泛分布于組織液中，血管內、外間隙中分布量大體相當。是機體抗感染的一種重要物質。

 

IgM是成熟胎兒合成的第一類Ig，也是在感染或免疫后最早產生的Ig，5類Ig中IgM最強，故其細胞毒活性和細胞溶解活性也最強。天然的血型抗體是IgM，有些自身抗體如抗磷脂抗體、RF等也屬于IgM。胎兒臍血中IgM抗體升高，是胎兒遭受感染的標志。

 

IgA在血清和組織液中的含量相對較少，血清型IgA含量占總Ig的15—25%，但在外分泌液如初乳、唾液、眼淚、腸道分泌液和支氣管分泌液中含量較高。由于IgA主要存在于外分泌液中，故在第一線抗感染防御中起重要作用。

 

IgE為單體結構，是正常人血清中含量最少的Ig。IgE在血清和組織液中含量極微，其主要生物學功能是與組織肥大細胞、嗜堿粒細胞表面的特異受體結合。IgE不能激活補體。IgE含量在正常人群波動較大，在特異性過敏反應和寄生蟲早期感染患者血清中可升高。當變態(tài)反應原與結合在受體上的IgE反應時，可引起肥大細胞、嗜堿粒細胞脫顆粒，釋放出組織胺、5—羥色胺等生物活性物質。

 

IgD在正常人血清中IgD濃度很低，幾乎檢測不到。IgD主要存在于人B淋巴細胞表面作為抗原的細胞受體，在血清中IgD含量極微且與膜結合的IgD有不同結構。B細胞上IgD的可變區(qū)與該細胞將分泌的IgG、IgA、IgM的可變區(qū)相同，當抗原與IgD受體結合時，刺激B細胞繁殖、分化、并分泌對抗原特異的其他類抗體。

 

哺乳動物抗體輕鏈大約由211–217個氨基酸殘基組成，共有兩型：kappa(κ)與lambda(λ)，同一個天然Ig分子上輕鏈的類型總是相同。但在同一個體內可存在分別帶有κ或λ鏈的抗體分子。不同種屬生物體內兩型輕鏈的比例不同，正常人血清免疫球蛋白κ鏈：λ鏈約為2：1，而在小鼠的比例為20：1。其他低等脊椎動物中存在iota（I）亞型輕鏈，如軟骨魚類和真骨魚類。

 

抗體的結構

免疫球蛋白Ig由4條多肽鏈通過鏈間和鏈內二硫鍵連接組成：兩條相同的相對分子質量較大的肽鏈（稱為重鏈，heavychain，H鏈，相對分子質量約為55000或70000）和兩條相同的相對分子質量較小的肽鏈（稱為輕鏈，light chain，L鏈，相對分子質量約為24000）組成。讓我們把抗體想象成在人的血液里飄浮著的成千上萬個雙齒的小叉。每個小叉的每個齒都可以黏結一個特定抗原的一個特定部位，這樣一個雙齒叉可以結合兩個同樣的抗原�？乖瓌t可以是外來或病變的蛋白，甚至包括入侵病原體（真菌、細菌、病毒等）的RNA、DNA或多聚糖。

 

可變區(qū)（Variable Region，V區(qū)）

抗體小叉與小叉之間在結構上的主要差異是位于齒端的可變區(qū)——這些可變區(qū)決定著抗體的抗原特異性。H鏈可變區(qū)約含118個氨基酸殘基和L鏈可變區(qū)約含108~111個氨基酸殘基�？勺儏^(qū)是抗體結合抗原的位置，其氨基酸的組成和排列決定抗體的抗原結合特異性�？勺儏^(qū)存在一些氨基酸能夠高頻變化組合的區(qū)域，這些區(qū)域稱為超變區(qū)(hypervariable region，HVR)，超變區(qū)又稱為互補決定區(qū)（
complementarity-determining region, CDR），超變區(qū)決定了抗體的獨特型（抗獨特型抗體表達）�？勺儏^(qū)中非HVR部位的氨基酸組成和排列相對比較保守，稱為骨架區(qū)（framework region，FR區(qū)）。VL中的CDR有三個，通常分別位于第24~34，89~97位氨基酸殘基，其中CDR3超變程度更高，抗體的特異性和親和力成熟主要涉及到該區(qū)域的改造。

恒定區(qū)（Constant Region， C區(qū)）

抗體小叉的柄部由一系列氨基酸序列基本不變的區(qū)域組成——我們稱之為恒定區(qū)。恒定區(qū)可以與細胞表面受體或補體系統(tǒng)蛋白相互作用，從而觸發(fā)宿主效應功能（effector function)，比如裂解入侵細胞或吞噬外來病原。抗體恒定區(qū)域位于H鏈靠近C端的3/4或4/5(約從119位氨基酸至C末端) 和L鏈靠近C端的1/2(約含105個氨基酸殘基)區(qū)域�？贵w重鏈恒定區(qū)分為CH1，CH2和CH3，其中CH3區(qū)域涉及到細胞膜表面受體結合，CH2涉及補體激活途徑，是補體結合位點。簡單來說，叉齒負責識別抗原，而叉柄則幫助宿主決定如何處置抗原。

 

抗體Fab段和Fc段

IgG經木瓜蛋白酶酶切后裂解為2個完全相同的Fab段和1個Fc段,每個Fab段都為單價,可與抗原結合但不會再發(fā)生凝集反應；經胃蛋白酶酶切后裂解為1個完整F(ab)2片段和碎片化的Fc片段,F(ab’)2片段為雙價,可同時結合兩個抗原表位。Fab段為抗原結合片段（fragment of antigen binding，Fab），相當于抗體分子的兩個臂，由一個完整的輕鏈和重鏈的VH和CH1結構域組成。Fc段為可結晶段（fragmentcrystallizable，Fc）相當于Ig的CH2和CH3結構域，是Ig與效應分子或者細胞相互作用的部位。Fab段包含完整的可變區(qū)，以及恒定區(qū)的CH1區(qū)域。Fc段僅指Ig恒定區(qū)CH2和CH3的區(qū)域，相當于Y字結構下面那一部分。

 

重鏈抗體的結構

駱駝類和軟骨魚類中天然缺失輕鏈的抗體又被稱為重鏈抗體，存在于亞洲的西亞駱駝（Camelusbactrianus）、非洲的單峰駝（C.dromedarius）和南美的大羊駝（Lama glama）、原駝（L.guanicoe）、羊駝（Vicugna pacos）和小羊駝（V.vicugna）等駱駝科中。

1995年又在護士鯊（Ginglymostoma cirratum）、斑紋須鯊（Oretolobus maculatus）、銀鮫等軟骨魚中發(fā)現了無輕鏈或其他蛋白分子伴隨的類似于重鏈抗體的抗原受體（new or nurse shark antigen receptor，NAR）。由于NAR分子與Ig亞型在跨膜和分泌方式等幾個功能特征方面近似，因此也被稱為免疫球蛋白新抗原受體（Ig new antigen receptor，IgNAR）。重鏈抗體具有廣泛應用價值的是單域重鏈抗體（single domainantibody，sdAb）部分。單域重鏈抗體是指僅由重鏈抗體可變區(qū)（Variable region）組成的基因工程抗體，又稱為VHH抗體（variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody，VHH antibody）或納米抗體（Nanobody，Nb），分子量為12-15 kD。

 

治療性抗體的發(fā)展階段

自1986年第一個治療性抗體進入臨床以來，治療性抗體得到了迅速的發(fā)展，到目前為止，FDA共批準了近百個治療性抗體藥物，其已成為現代生物醫(yī)藥的重要組成部分。伴隨現代科技的發(fā)展，治療性抗體經歷了鼠源性抗體，嵌合抗體，改性抗體和表面重塑抗體（部分人源化抗體），以及全人源化抗體等不同發(fā)展階段。

第一代：鼠源單抗（momab）

1986年，也就是在Milstein和Kohler憑借單抗雜交瘤技術獲得諾貝爾獎后的第二年，強生的Orthoclone OKT3成為第一個被美國FDA批準的單抗藥，用于防止腎臟移植后的宿主排斥。但直到9年以后，第二個抗體藥——禮來和強生的ReoPro——才于1995年在美國上市，被用來抑制血栓形成。

 

第一個單克隆抗體藥Orthoclone OKT3來自于小鼠，它的氨基酸序列都是鼠源的。鼠源抗體在給病人服用過程中常常遇到一些問題：

 

1）人體把這些單抗藥當作異體蛋白，會產生免疫排斥。

 

2）免疫排斥使單抗藥很快從病人體內被清除掉，大大降低了它們應有的療效。尤其治療慢性疾病需要長期服用的情況下，鼠源單抗藥在后續(xù)注射時療效甚微；

 

3）少數病例中，鼠源抗體會引起嚴重的過敏反應，甚至導致了個別病人的死亡。因此，早期單抗藥的銷售始終沒有騰飛——Orthoclone OKT3的年銷售額僅有1千萬美元左右。

 

單抗藥要想在江湖上立足，要想在醫(yī)學上有更廣泛的應用，必須要轉變成人源化抗體或人源抗體。

 

第二代：人鼠嵌合單抗（ximab）和人源化單抗（zumab）

這里我們有必要區(qū)分一下人源化抗體和人源抗體。人源化抗體一般是以鼠源抗體為基礎，通過更換蛋白片斷和置換部分氨基酸序列， 使抗體的最終氨基酸序列更接近人源的。而人源抗體是任何能被人體B細胞表達的抗體，其氨基酸序列是100%由人的基因編碼的。

 

20世紀90年代，以美國為主出現了幾十家生物技術公司。他們個個身懷絕技——他們的技術平臺都是圍繞如何將抗體人源化或直接產生人源抗體而建立的，他們的目的都是將抗體藥發(fā)揚光大。以研發(fā)抗體藥為主的公司在當時的江湖上分兩大流派。

 

第一個流派可以稱之為抗體蛋白工程派或人源化派。單抗在小鼠中產生后，它的部分氨基酸序列或被置換，或被拼接組合，其最終目的是既不引起人的免疫排斥，又不降低它對靶抗原的親和性。這一流派又分為兩個層次。

 

第一個層次是嵌合抗體（Chimeric antibody）: 抗體的恒定區(qū)都被置換成人的氨基酸序列。嵌合單抗蛋白約33%的氨基酸序列來自小鼠，其余67%為人源的。

 

第二個層次是人源化抗體(Humanized antibody)，即拿到針對某抗原的小鼠抗體后，只取其識別抗原的幾段區(qū)域（CDR區(qū)域），把它們移植到人源抗體中。人源化單抗中人源的序列占90%。人源化單抗顯然比嵌合單抗更有優(yōu)勢，引起免疫排斥或超敏的風險更低。人源化單抗技術的代表公司為Protein Design Labs, 或PDL。基因泰克幾個著名的單抗藥——Herceptin, Xolair和Avastin——的人源化都需要獲得PDL的技術許可。人源化單抗技術最大的缺點是缺乏通用的方法。每個抗體分子的人源化，都需要個案分析、分子建模、大量的改造和試錯。即使這樣，由于鼠源序列的存在，人源化單抗還是不能完全避免免疫排斥或超敏的風險。

第三代：全人源化單抗（mumab）

抗體藥的第二個流派是全人源單抗。這一流派又分為兩大門派：噬菌體展示和轉基因小鼠。

 

用噬菌體展示技術產生抗體完全避免了動物的使用。在這一技術中，先通過PCR技術建立一個以噬菌體質粒為載體的、表達無數個人源抗體可變區(qū)的基因庫。當大腸桿菌被這些質粒轉染后，千百萬個噬菌體被釋放出來。每個噬菌體表面呈現一個獨特的抗體可變區(qū)片斷。含有這些噬菌體混合物的溶液，在流過附著特定抗原的固態(tài)基質后，粘在基質表面、洗不走的往往是呈現特異性抗體的噬菌體顆粒。特異性抗體的基因再進一步被擴增、純化。這一流派的代表公司包括CAT和Dyax。

 

轉基因小鼠技術出道雖晚，但技術優(yōu)勢卻最為明顯。該技術通過轉基因的手段把小鼠自身的抗體表達系統(tǒng)破壞掉，再引進人的抗體生成系統(tǒng)。這種轉基因小鼠針對某種抗原就可以直接產生全人源的抗體。

 

噬菌體展示和轉基因小鼠在執(zhí)行過程中各有千秋。一般來說，噬菌體展示技術“先快后慢”，即找到針對某種靶蛋白的抗體很快，但選出的這個抗體和靶蛋白的親和性往往不高，需要人工細調，更換個別氨基酸。優(yōu)化這一步費時費力，而且即使優(yōu)化的抗體和通過轉基因小鼠出來的抗體相比，親和力可能還是相差一個數量級。另外，在優(yōu)化的過程中需要替換一些氨基酸，也就引進了被免疫排斥的風險。轉基因小鼠技術是“先慢后快”，將抗原注射到小鼠體內、產生特異抗體、制備雜交瘤細胞等前幾步需要幾個月的時間。但一旦最初的抗體產生，其優(yōu)化過程在小鼠體內繼續(xù)完成，又快又好，并且不用擔心免疫排斥的問題。

 

在這里要不得不提到全球第一個上市的全人源抗體—阿達木單抗（修美樂）。阿達木單抗始于1993年巴斯夫子公司BASF Knoll和劍橋抗體技術公司(Cambridge Antibody Technology，CAT)的合力研究。劍橋抗體技術以TNFα為抗原使用它們特有的噬菌體展示技術在體外篩選中得到了全人抗體D2E7。在隨后的研究中，BASF Knoll進一步對全人抗體D2E7進行了完善，并完成了前期的生產工藝開發(fā)和臨床申報。

 

2002年6月，美國雅培制藥（Abbott）以69億美元收購BASF Knoll，獲得了全人抗體D2E7的開發(fā)生產和銷售權，最終將阿達木單抗推向市場。自2002年首次獲得FDA批準上市以來，阿達木單抗已經累計創(chuàng)造了1161億美元的銷售收入，2017年的美國市場增速為18.5%，全球市場增速為14.6%，因此直到今天仍然以每年兩位數的增幅刷新單只藥品的年度銷售記錄。

 

小 結

抗體藥物從發(fā)現到進入臨床應用，經歷了曲折而又漫長的歷程。在這段時間里，人們對于抗體藥物的認識發(fā)生了巨大的變化。在過去的十年里，抗體已經成為醫(yī)藥市場上最暢銷的藥物。預估 2021 年全球十大暢銷的藥物中，就會有 5 個抗體類藥物。因此，隨著抗體類藥物被批準用于治療各種包括癌癥、自身免疫、代謝和傳染病，治療性抗體藥物的市場必會呈現爆炸式增長的態(tài)勢。

 

來源：生物藥學科普

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