AVATAR在精準模擬患者腫瘤微環(huán)境探尋腫瘤進展背后機制的應(yīng)用
腫瘤微環(huán)境（TME）是指腫瘤在生長過程中、與腫瘤的發(fā)生，發(fā)展和轉(zhuǎn)移密不可分的局部穩(wěn)態(tài)環(huán)境，它有幾個不同于正常組織的生理學特征，如腫瘤間質(zhì)液壓增高和缺氧。
圖1. 正常組織和腫瘤微環(huán)境的區(qū)別
腫瘤間質(zhì)液壓是決定腫瘤血供和營養(yǎng)以及血液攜帶的治療劑釋放入腫瘤的重要參數(shù)，腫瘤間質(zhì)液壓增高會造成惡性腫瘤放療、化療、免疫治療困難。同樣，缺氧微環(huán)境對腫瘤細胞具有篩選作用，能夠使腫瘤的惡性程度進一步提高，導致腫瘤細胞對化療藥物或放射治療不敏感，最終導致腫瘤轉(zhuǎn)移和耐藥性。
因此，在體外模擬腫瘤微環(huán)境是一種研究腫瘤非常重要且必要的手段，它可以更好地指導臨床治療，實現(xiàn)癌癥的個性化精準醫(yī)療。
AVATAR個體化細胞控制系統(tǒng)可以自由控制培養(yǎng)環(huán)境中的氧氣含量和壓力強度，在體外精準模擬出加壓和缺氧的腫瘤微環(huán)境條件，使研究人員能夠在接近真實的環(huán)境中研究藥物作用機制、評估治療效果，得到更加科學的結(jié)果，同時也減少項目的優(yōu)化時間與成本費用。
圖2. AVATAR個體化細胞控制系統(tǒng)
目前，AVATAR在世界范圍內(nèi)已有廣泛應(yīng)用，以下是AVATAR在前列腺癌細胞系耐藥性研究中的一個應(yīng)用案例。
探究前列腺癌細胞系的耐藥性
實驗背景
恩雜魯胺（Enzalutamide）是一類口服類雄激素受體拮抗劑，已被美國FDA批準用于前列腺癌化療后進展的轉(zhuǎn)移性去勢耐受前列腺癌的患者（即前列腺腫瘤或癌細胞隨經(jīng)化療但病灶仍然在生長的患者）的治療，可延長患者生存期。但遺憾的是在治療過程中幾乎所有患者都會產(chǎn)生耐藥性。
AR-V7的表達是對恩雜魯胺耐藥的生物標志物之一。恩雜魯胺在人體中可以靶向作用于雄激素受體（AndrogenReceptor，AR）上的LBD結(jié)構(gòu)域，使雄激素不能與AR結(jié)合，阻斷AR信號通路，因此達到治療的效果。而AR-V7可以直接使恩雜魯胺無法與AR結(jié)合，導致前列腺癌患者對恩雜魯胺產(chǎn)生耐藥性。
為了確定前列腺癌細胞中對恩雜魯胺治療耐藥的機制，并生成篩選和評估化療藥物的模型，研究人員使用AVATAR系統(tǒng)模擬腫瘤組織微環(huán)境，使人前列腺癌細胞22Rv1和LNCaP在腫瘤間質(zhì)液壓增高和缺氧培養(yǎng)條件下（2 PSI+1%O2）培養(yǎng)，然后評估細胞生長、基因表達譜和恩雜魯胺治療的藥物反應(yīng)。
實驗結(jié)果
1. 腫瘤微環(huán)境條件下，人前列腺癌細胞對恩雜魯胺的耐藥性增強
圖3. 前列腺癌細胞在TME條件下誘導了對恩雜魯胺治療的耐藥性
人前列腺癌細胞22Rv1（A）和LNCaP（B）細胞在對照組（CO2培養(yǎng)箱）和實驗組（腫瘤微環(huán)境條件：1%O2，0/2 PSI）培養(yǎng)兩個月，實驗組中的癌細胞對恩雜魯胺產(chǎn)生耐藥性。
2. 腫瘤微環(huán)境條件誘導前列腺癌細胞表達雄激素受體，尤其是AR-V7
圖4. 前列腺癌細胞在TME條件下AR-V7的表達情況
qPCR（A）和western blot（B）檢測腫瘤微環(huán)境條件下前列腺癌細胞22Rv1 中AR和AR-V7的表達，結(jié)果顯示，腫瘤微環(huán)境條件誘導前列腺癌細胞表達雄激素受體，尤其是AR-V。圖4為三個獨立實驗的代表性結(jié)果*P＜0.05**P＜0.01。
3. 腫瘤微環(huán)境條件改變了前列腺癌細胞22Rv1和LNCaP的基因表達譜
圖5.腫瘤微環(huán)境條件下前列腺癌細胞22Rv1和LNCaP的轉(zhuǎn)錄組學分析
（A）22Rv1和LNCaP細胞在TME條件下基因表達顯著上調(diào)和顯著下調(diào)的基因數(shù)量。（B）22Rv1和LNCaP細胞在TME條件下基因表達上調(diào)和下調(diào)的維恩圖。（C）基因集富集分析（GSEA）繪制了22Rv1和LNCaP細胞缺氧、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和外源代謝的標志性特征。（D）22Rv1和LNCaP細胞中顯著富集途徑的GSEA特征富集總譜。
4. 腫瘤微環(huán)境條件適應(yīng)的前列腺癌細胞中KDM3A表達的上調(diào)有助于AR-V7表達的增加
圖6. 腫瘤微環(huán)境上調(diào)22Rv1和LNCaP細胞中組蛋白去甲基化酶KDM3A的表達
前列腺癌細胞22Rv1（A）和LNCaP（B）中前20個差異表達基因的熱圖。qPCR結(jié)果證實，在TME條件下，22Rv1和LNCaP細胞中KDM3A的表達上調(diào)（C）。Western blot結(jié)果顯示，在TME條件下，HIF-1α和KDM3A蛋白水平增加（D）。KDM3A促進AR-V7的選擇性剪接，導致在TME條件下AR-V8的更高水平，并誘導PSA蛋白表達。
5. 在腫瘤微環(huán)境條件培養(yǎng)的前列腺癌細胞系顯示波形蛋白表達增加
圖7. 腫瘤微環(huán)境誘導22Rv1和LNCaP細胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）
將22Rv1和LNCaP細胞在腫瘤微環(huán)境條件或標準CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，通過免疫熒光染色（A）、qPCR（B）和Western blot（C）分析上皮細胞標記物E-鈣粘蛋白（CDH1）和間充質(zhì)細胞標記物波形蛋白（VIM）的表達。結(jié)果表明，在腫瘤微環(huán)境條件下，22Rv1和LNCaP細胞中的間充質(zhì)細胞標記物VIM上調(diào)。
實驗結(jié)論
作者比較了前列腺癌細胞的細胞生長、基因表達譜和對恩雜魯胺治療的藥物反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)適應(yīng)腫瘤微環(huán)境培養(yǎng)條件可以促進前列腺癌細胞系中AR-V7的表達，并有助于對恩雜魯胺的耐藥性。細胞系對腫瘤微環(huán)境培養(yǎng)條件的適應(yīng)可以為耐藥機制提供有意義的見解，同時為鑒定耐藥靶點和生物標志物提供一種新的方法。
1.創(chuàng)造低氧高壓條件，模擬體內(nèi)微環(huán)境
自由控制氧氣含量和壓力強度，為所研究的細胞創(chuàng)造符合其在體內(nèi)的微環(huán)境。
2.縮小體外與體內(nèi)細胞實驗結(jié)果間的差異
模擬細胞在體內(nèi)的微環(huán)境，因此細胞的狀態(tài)也就更加真實，實驗結(jié)果和體內(nèi)實驗相當。
3.有效精準控制細胞狀態(tài)
除了可模擬體內(nèi)微環(huán)境外，更可借由參數(shù)的調(diào)整與優(yōu)化，控制細胞的狀態(tài)與命運（如維持干細胞干性表征、定向誘導干細胞分化、提高基因編輯與轉(zhuǎn)染的效率等），相較傳統(tǒng)方式能更有效的提高反應(yīng)效果，不僅可縮短時效，更可減低實驗過程中所需成本花費。
4.多通道且獨立的設(shè)計和便捷的可升級性
研究者可根據(jù)需求選擇多臺獨立腔體疊加放置，同時設(shè)置不同的環(huán)境條件。研究者可以橫跨不同的生理理狀態(tài)去評估細胞的基因與功能，或根據(jù)需求，采取多參數(shù)設(shè)置模式快速獲得更佳的生長條件，大幅減少優(yōu)化時間與成本花費。
5.空間占用小
可靈活地放置于任何常規(guī)環(huán)境，也可放置于特定空間，如超凈工作臺等，適合特殊應(yīng)用需求，如病毒或病原相關(guān)研究。
6. 顯著降低運行成本
設(shè)備配置精密感應(yīng)器與氣體控制部件，因此可較傳統(tǒng)培養(yǎng)裝置降低≥90%的⽓體消耗。
圖1. 正常組織和腫瘤微環(huán)境的區(qū)別
腫瘤間質(zhì)液壓是決定腫瘤血供和營養(yǎng)以及血液攜帶的治療劑釋放入腫瘤的重要參數(shù)，腫瘤間質(zhì)液壓增高會造成惡性腫瘤放療、化療、免疫治療困難。同樣，缺氧微環(huán)境對腫瘤細胞具有篩選作用，能夠使腫瘤的惡性程度進一步提高，導致腫瘤細胞對化療藥物或放射治療不敏感，最終導致腫瘤轉(zhuǎn)移和耐藥性。
因此，在體外模擬腫瘤微環(huán)境是一種研究腫瘤非常重要且必要的手段，它可以更好地指導臨床治療，實現(xiàn)癌癥的個性化精準醫(yī)療。
AVATAR個體化細胞控制系統(tǒng)可以自由控制培養(yǎng)環(huán)境中的氧氣含量和壓力強度，在體外精準模擬出加壓和缺氧的腫瘤微環(huán)境條件，使研究人員能夠在接近真實的環(huán)境中研究藥物作用機制、評估治療效果，得到更加科學的結(jié)果，同時也減少項目的優(yōu)化時間與成本費用。
圖2. AVATAR個體化細胞控制系統(tǒng)
目前，AVATAR在世界范圍內(nèi)已有廣泛應(yīng)用，以下是AVATAR在前列腺癌細胞系耐藥性研究中的一個應(yīng)用案例。
探究前列腺癌細胞系的耐藥性
實驗背景
恩雜魯胺（Enzalutamide）是一類口服類雄激素受體拮抗劑，已被美國FDA批準用于前列腺癌化療后進展的轉(zhuǎn)移性去勢耐受前列腺癌的患者（即前列腺腫瘤或癌細胞隨經(jīng)化療但病灶仍然在生長的患者）的治療，可延長患者生存期。但遺憾的是在治療過程中幾乎所有患者都會產(chǎn)生耐藥性。
AR-V7的表達是對恩雜魯胺耐藥的生物標志物之一。恩雜魯胺在人體中可以靶向作用于雄激素受體（AndrogenReceptor，AR）上的LBD結(jié)構(gòu)域，使雄激素不能與AR結(jié)合，阻斷AR信號通路，因此達到治療的效果。而AR-V7可以直接使恩雜魯胺無法與AR結(jié)合，導致前列腺癌患者對恩雜魯胺產(chǎn)生耐藥性。
為了確定前列腺癌細胞中對恩雜魯胺治療耐藥的機制，并生成篩選和評估化療藥物的模型，研究人員使用AVATAR系統(tǒng)模擬腫瘤組織微環(huán)境，使人前列腺癌細胞22Rv1和LNCaP在腫瘤間質(zhì)液壓增高和缺氧培養(yǎng)條件下（2 PSI+1%O2）培養(yǎng)，然后評估細胞生長、基因表達譜和恩雜魯胺治療的藥物反應(yīng)。
實驗結(jié)果
1. 腫瘤微環(huán)境條件下，人前列腺癌細胞對恩雜魯胺的耐藥性增強
圖3. 前列腺癌細胞在TME條件下誘導了對恩雜魯胺治療的耐藥性
人前列腺癌細胞22Rv1（A）和LNCaP（B）細胞在對照組（CO2培養(yǎng)箱）和實驗組（腫瘤微環(huán)境條件：1%O2，0/2 PSI）培養(yǎng)兩個月，實驗組中的癌細胞對恩雜魯胺產(chǎn)生耐藥性。
2. 腫瘤微環(huán)境條件誘導前列腺癌細胞表達雄激素受體，尤其是AR-V7
圖4. 前列腺癌細胞在TME條件下AR-V7的表達情況
qPCR（A）和western blot（B）檢測腫瘤微環(huán)境條件下前列腺癌細胞22Rv1 中AR和AR-V7的表達，結(jié)果顯示，腫瘤微環(huán)境條件誘導前列腺癌細胞表達雄激素受體，尤其是AR-V。圖4為三個獨立實驗的代表性結(jié)果*P＜0.05**P＜0.01。
3. 腫瘤微環(huán)境條件改變了前列腺癌細胞22Rv1和LNCaP的基因表達譜
圖5.腫瘤微環(huán)境條件下前列腺癌細胞22Rv1和LNCaP的轉(zhuǎn)錄組學分析
（A）22Rv1和LNCaP細胞在TME條件下基因表達顯著上調(diào)和顯著下調(diào)的基因數(shù)量。（B）22Rv1和LNCaP細胞在TME條件下基因表達上調(diào)和下調(diào)的維恩圖。（C）基因集富集分析（GSEA）繪制了22Rv1和LNCaP細胞缺氧、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和外源代謝的標志性特征。（D）22Rv1和LNCaP細胞中顯著富集途徑的GSEA特征富集總譜。
4. 腫瘤微環(huán)境條件適應(yīng)的前列腺癌細胞中KDM3A表達的上調(diào)有助于AR-V7表達的增加
圖6. 腫瘤微環(huán)境上調(diào)22Rv1和LNCaP細胞中組蛋白去甲基化酶KDM3A的表達
前列腺癌細胞22Rv1（A）和LNCaP（B）中前20個差異表達基因的熱圖。qPCR結(jié)果證實，在TME條件下，22Rv1和LNCaP細胞中KDM3A的表達上調(diào)（C）。Western blot結(jié)果顯示，在TME條件下，HIF-1α和KDM3A蛋白水平增加（D）。KDM3A促進AR-V7的選擇性剪接，導致在TME條件下AR-V8的更高水平，并誘導PSA蛋白表達。
5. 在腫瘤微環(huán)境條件培養(yǎng)的前列腺癌細胞系顯示波形蛋白表達增加
圖7. 腫瘤微環(huán)境誘導22Rv1和LNCaP細胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）
將22Rv1和LNCaP細胞在腫瘤微環(huán)境條件或標準CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，通過免疫熒光染色（A）、qPCR（B）和Western blot（C）分析上皮細胞標記物E-鈣粘蛋白（CDH1）和間充質(zhì)細胞標記物波形蛋白（VIM）的表達。結(jié)果表明，在腫瘤微環(huán)境條件下，22Rv1和LNCaP細胞中的間充質(zhì)細胞標記物VIM上調(diào)。
實驗結(jié)論
作者比較了前列腺癌細胞的細胞生長、基因表達譜和對恩雜魯胺治療的藥物反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)適應(yīng)腫瘤微環(huán)境培養(yǎng)條件可以促進前列腺癌細胞系中AR-V7的表達，并有助于對恩雜魯胺的耐藥性。細胞系對腫瘤微環(huán)境培養(yǎng)條件的適應(yīng)可以為耐藥機制提供有意義的見解，同時為鑒定耐藥靶點和生物標志物提供一種新的方法。
AVATAR 具體有哪些優(yōu)勢？
1.創(chuàng)造低氧高壓條件，模擬體內(nèi)微環(huán)境
自由控制氧氣含量和壓力強度，為所研究的細胞創(chuàng)造符合其在體內(nèi)的微環(huán)境。
2.縮小體外與體內(nèi)細胞實驗結(jié)果間的差異
模擬細胞在體內(nèi)的微環(huán)境，因此細胞的狀態(tài)也就更加真實，實驗結(jié)果和體內(nèi)實驗相當。
3.有效精準控制細胞狀態(tài)
除了可模擬體內(nèi)微環(huán)境外，更可借由參數(shù)的調(diào)整與優(yōu)化，控制細胞的狀態(tài)與命運（如維持干細胞干性表征、定向誘導干細胞分化、提高基因編輯與轉(zhuǎn)染的效率等），相較傳統(tǒng)方式能更有效的提高反應(yīng)效果，不僅可縮短時效，更可減低實驗過程中所需成本花費。
4.多通道且獨立的設(shè)計和便捷的可升級性
研究者可根據(jù)需求選擇多臺獨立腔體疊加放置，同時設(shè)置不同的環(huán)境條件。研究者可以橫跨不同的生理理狀態(tài)去評估細胞的基因與功能，或根據(jù)需求，采取多參數(shù)設(shè)置模式快速獲得更佳的生長條件，大幅減少優(yōu)化時間與成本花費。
5.空間占用小
可靈活地放置于任何常規(guī)環(huán)境，也可放置于特定空間，如超凈工作臺等，適合特殊應(yīng)用需求，如病毒或病原相關(guān)研究。
6. 顯著降低運行成本
設(shè)備配置精密感應(yīng)器與氣體控制部件，因此可較傳統(tǒng)培養(yǎng)裝置降低≥90%的⽓體消耗。
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