單克隆抗體發(fā)現(xiàn)技術(shù)——單B細胞技術(shù)

單克隆抗體（mAb）具有高度的特異性，功能上遠超多克隆抗體（pAb），是制藥市場上最重要的生物藥類型之一，被廣泛用作高度特異性的診斷工具、治療藥物開發(fā)。自1986年美國FDA批準第一個治療性mAb——OrthocloneOKT3（抗CD3mAb）以來，已有超過100個mAb獲得FDA批準。
目前獲得單克隆抗體的主要技術(shù)有哪些？
1）雜交瘤技術(shù)
雜交瘤技術(shù)是第一個開發(fā)用于分離mAb的技術(shù)，也稱為B淋巴細胞（簡稱B細胞）永生化技術(shù)，自其發(fā)展以來，已經(jīng)徹底改變了mAb的發(fā)現(xiàn)。該技術(shù)的原理是通過與骨髓瘤細胞融合使短壽命的B細胞永生化，產(chǎn)生單克隆永生化雜交瘤細胞系，然后篩選其上清液中的抗原特異性克隆，并進一步亞克隆循環(huán)以產(chǎn)生嚴格的單克隆性，通常亞克隆2~3個循環(huán)。

Fig.1 雜交瘤技術(shù)流程
不足之處：雜交瘤抗體開發(fā)周期長，不包括免疫，大約需要4-6個月。受雜交瘤融合率限制，整個B細胞群中只有一小部分B細胞完成融合，絕大部分丟失，不適于對大型抗體庫進行全面篩選。此外，同一培養(yǎng)物中不同雜交瘤之間存在競爭，一些不分泌或低分泌克隆可能表現(xiàn)出更快的生長速度，超過高分泌克隆。
2）展示技術(shù)
發(fā)現(xiàn)和選擇單克隆抗體的方法還有展示技術(shù)，如噬菌體、酵母展示。目前噬菌體展示已經(jīng)成功地用于篩選大量抗體庫。噬菌體展示技術(shù)的原理是將一段外源基因插入到噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)基因的適當位置，在閱讀框正常且不影響外殼蛋白正常功能的情況下，外源基因會隨著外殼蛋白的表達而表達，從而使多肽或蛋白以融合蛋白的形式展現(xiàn)在噬菌體表面。

Fig.2 展示技術(shù)流程​
不足之處：抗體開發(fā)中獲得天然VH-VL配對至關(guān)重要，然而展示技術(shù)通常依賴于隨機組合，形成非自然的VH-VL抗體配對。有研究指出人類B細胞庫的理論為10 ¹²-10 ¹⁸個，但由于樣本量、V(D)J重組過程中插入的框外突變以及自反應BCR刪除等原因，體內(nèi)不同B細胞克隆的實際數(shù)量約為1×10 ⁷ –2×10 ⁷個，而在噬菌體等展示技術(shù)中，初始B細胞庫的大小通常大于10 ⁹，數(shù)量遠超天然B細胞庫，VH-VL非天然配占比較大。
3）最新單抗發(fā)現(xiàn)技術(shù)-單B細胞抗體技術(shù)
原代抗原特異性B細胞是獲得抗原特異性mAb的主要來源，單B細胞抗體技術(shù)可以以隨機或抗原選擇方式從外周血或淋巴組織中直接分離單B細胞。隨機B細胞分離可以通過顯微操作、激光捕獲顯微切割和熒光激活細胞分選（FACS）等方法進行細胞挑選�？乖�選擇可以通過使用抗原包被的磁珠、多參數(shù)FACS的熒光染料標記抗原、溶血斑塊實驗和熒光焦點等方法篩選抗原特異性B細胞。

Fig3. 單B細胞抗體技術(shù)流程
單B細胞抗體技術(shù)的優(yōu)勢
單B細胞抗體技術(shù)用相對較少的細胞，即可獲得特異性單克隆抗體，mAb開發(fā)效率極高。單B細胞抗體技術(shù)可以分離出難以在體外模擬的構(gòu)象決定因素的功能性mAb。FACS技術(shù)還可根據(jù)特定細胞表面marker的表達模式，清楚地區(qū)分待分選B細胞的發(fā)育和分化階段，幾乎任何階段的B細胞都可以分選。通過單B細胞獲得的mAb，體內(nèi)天然成熟，對靶標具有相當高的特異性。此外，單B細胞抗體技術(shù)可以直接從人類標本或全人源轉(zhuǎn)基因小鼠PBMC中獲得人源抗體，方便快捷，遠比通過其他物種（例如小鼠、大鼠和兔）的mAb進行人源化更容易、有效。德泰生物提供SingleB^®快速單抗發(fā)現(xiàn)服務，從動物免疫到100株單抗，僅需29天，比傳統(tǒng)雜交瘤技術(shù)至少節(jié)省120天。直接篩選特異性記憶B細胞和漿細胞，抗體多樣性豐富。