應(yīng)用紀(jì)要：Incucyte+Octet助力2022年諾獎得主研究

瑞典皇家科學(xué)院10月5日宣布，將2022年諾貝爾化學(xué)獎授予科學(xué)家Carolyn R. Bertozzi、Morten Meldal和K. Barry Sharpless，以表彰他們在“點擊化學(xué)和生物正交化學(xué)”方面所做出的貢獻(xiàn)。
   
CR. Bertozzi是第一個提出生物正交反應(yīng)概念的人。生物正交反應(yīng)是指在活體細(xì)胞或組織中，能夠在不干擾生物自身生化反應(yīng)條件下可以進(jìn)行的化學(xué)反應(yīng)，是化學(xué)生物學(xué)中非常重要的工具。生物正交反應(yīng)必須發(fā)生在復(fù)雜的生命條件下，與點擊反應(yīng)一樣溫和且高效，且具有高選擇性。
 
那么生物正交反應(yīng)和近期火熱的免疫治療有什么關(guān)系呢？

CR. Bertozzi課題組就用這種反應(yīng)將唾液酸酶和一種抗體藥物（曲妥珠單抗）偶聯(lián)物T-Sia 2形成一種新的免疫檢查點抑制劑療法，并在《Nature》子刊上發(fā)表了題為Targeted glycan degradation potentiates the anticancer immune response in vivo [1]的文章(以下用“該文”表示)。

 
唾液酸酶的作用

唾液酸殘基（基本單糖結(jié)構(gòu)單元之一）在腫瘤細(xì)胞中上調(diào)，與受體Siglecs結(jié)合可形成免疫抑制效果。而唾液酸酶可以除掉這些唾液酸，阻斷Siglecs-唾液酸的相互作用。
 
抗體和唾液酸酶的偶聯(lián)方式就是著名的生物正交反應(yīng)——具有張力的環(huán)狀炔與疊氮的無金屬催化的點擊反應(yīng)。
 
在偶聯(lián)抗體生成后仍需要面臨兩個問題：酶和抗體之間linker是否穩(wěn)定？考慮到抗體需要有ADCC等效應(yīng)來殺死腫瘤，修飾后的抗體是否還有Fc受體的結(jié)合活性？

該文使用Sartorius的Incucyte®  實時活細(xì)胞分析系統(tǒng) 進(jìn)行l(wèi)inker穩(wěn)定性分析。

用熒光基團(tuán)標(biāo)記不同linker（oxime或HIPS）偶聯(lián)抗體，可通過熒光強弱與熒光持續(xù)性判斷l(xiāng)inker的穩(wěn)定性。使用Incucyte® 進(jìn)行活細(xì)胞實時成像，發(fā)現(xiàn)HIPS比較穩(wěn)定，同時克服了抗體和酶之間先前使用的肟鍵的不穩(wěn)定性。
  C 圖 正常培養(yǎng)基活細(xì)胞培養(yǎng)；
D 圖 加入蛋白酶抑制劑活細(xì)胞培養(yǎng)；
E 圖 固定細(xì)胞；
HIPS為紅色，oxime為藍(lán)色。
分析參數(shù)：
使用Top-Hat減噪算法半徑為100-μm；
熒光閾值:0.2 RCU；
邊界靈敏度 −25；
中空填充：200 μm2；
最大面積 2,600 μm2 ；
使用積分熒光面積輸出結(jié)果。

抗體和Fc受體的結(jié)合活性作為抗體藥物的重要表征方法，該文通過Octet® 非標(biāo)記分子互作系統(tǒng)進(jìn)行分析。發(fā)現(xiàn)偶聯(lián)后的抗體藥物（T-Sia2）與Fc受體的親和力與未偶聯(lián)的藥物類似。
  用鏈霉親和素傳感器（SA）固化生物素化的Fc受體，與100 nM的抗體或者抗體偶聯(lián)物結(jié)合20 s，解離40 s。

在制備一些對照蛋白的時候，也用到了Octet® 檢測其與Fc受體的親和力（數(shù)據(jù)未列出）。

T-Sia 2在移植了同系HER2+癌細(xì)胞的小鼠模型中，作者觀察到腫瘤生長延遲，并且證明與腫瘤唾液酸減少有關(guān)。在動物試驗中也說明了這種方法的可行性。生物正交反應(yīng)在活細(xì)胞成像、藥物可控靶向釋放、抗體藥物偶聯(lián)，甚至聚合物化學(xué)、材料表面化學(xué)領(lǐng)域均有應(yīng)用，而該文就是在抗體藥物偶聯(lián)中的一個案例。

CR. Bertozzi課題組在多篇文章中都使用了Incucyte® 實時活細(xì)胞分析系統(tǒng)和Octet® 非標(biāo)記分子互作系統(tǒng)。好馬配好鞍，Octet® 和Incucyte® 不愧為2022年諾獎得主都在用的實驗神器！那為什么大家都爭先恐后的使用這兩款神器呢？
 
 
使用Incucyte® 實時活細(xì)胞分析系統(tǒng)的優(yōu)勢

• 培養(yǎng)箱內(nèi)可長達(dá)數(shù)周的連續(xù)觀察，最短幾分鐘間隔拍攝，減少人力，防止過多操作對細(xì)胞的傷害；如該文每隔2個小時拍攝，共拍攝4天。
• 6個板位，分別獨立設(shè)置檢測程序，可以兼容各種孔板和培養(yǎng)皿，通量高；如該文有各種免疫抑制劑、效靶比等實驗組，Incucyte® 一次可以完成所有實驗組實驗。
• 高效簡便的模塊化軟件設(shè)置和數(shù)據(jù)分析，輸出圖片、視頻、生長曲線等多指標(biāo)多參數(shù)；該文提到了使用Incucyte®多個參數(shù)的調(diào)節(jié)，使得結(jié)果更加準(zhǔn)確。
• 大于100種優(yōu)化過的活細(xì)胞專用熒光試劑、耗材及詳盡的Protocol，文章數(shù)大于12000篇。

 
 
使用Octet® 非標(biāo)記分子互作系統(tǒng)的優(yōu)勢

近年來，諸多諾貝爾獎獲得者都用到了Octet® 非標(biāo)記分子互作系統(tǒng)作為實驗研究的重要工具：
2021｜諾貝爾獎得主教你用BLI技術(shù)“感知痛覺”！
2020｜諾獎獲得者教你做分子互作競爭實驗
2020｜告別EMSA，試試CRISPR女神用的核酸互作神器
 

• 非標(biāo)記Direct Binding是趨勢，它的結(jié)果更加準(zhǔn)確。
• 快速測定親和力，更加定量化對互作進(jìn)行表征。
• 無洗滌步驟，可測弱親和力（解離快）；如該文Fc受體解離快，無法用帶洗滌的傳統(tǒng)方法建立結(jié)合活性檢測。
• 測試時間短，一般10分鐘，更快拿到結(jié)果；如該文5分鐘就可以完成實驗。
• 實驗形式多樣化：定性，兩者結(jié)合，協(xié)同/競爭實驗，垂釣。
• 寫入美國藥典，文章>10000篇，認(rèn)可度廣。
• 萬金油技術(shù)，可以用與檢測DNA、小分子、蛋白等各種生物分子。
• 使用方便，成本相對較低。

 
再好的idea與成就，也需要用強有力的手段和工具去實現(xiàn)，Incucyte® 實時活細(xì)胞分析系統(tǒng)和Octet® 非標(biāo)記分子互作系統(tǒng)，來自諾獎得主的制勝法寶！
 

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《活細(xì)胞分析在免疫學(xué)中的十大應(yīng)用》


-參考文獻(xiàn)-
[1]Carolyn R. Bertozzi  et al.Targeted glycan degradation potentiates the anticancer immune response in vivo.Nature Chemical Biology volume 16, pages1376–1384 (2020)