巨噬細(xì)胞在ibidi腔室通道載玻片培養(yǎng)處理活細(xì)胞與免疫熒光的應(yīng)用
下面的應(yīng)用描述了小鼠巨噬細(xì)胞系RAW-264.7（生物安全等級2）在ibidi µ-Slides VI 0.4 和8孔腔室載玻片的培養(yǎng)方案。這是一個特殊的細(xì)胞系的例子，用于顯示粘附時間，細(xì)胞密度和細(xì)胞形態(tài)的示范。這個應(yīng)用可以根據(jù)于您的特殊實驗要求進(jìn)行調(diào)整。
2.實驗材料
在設(shè)置中應(yīng)用下列材料：
·RAW-264.7 (murine macrophages, CLS - Cell Lines Service, Biosafety Level 2)
· Medium: RPMI 1640 with 2 mM L-Glutamin and 10% FBS
· µ-Slide VI 0.4, ibiTreat （ibidi）
· µ-Slide 8 well, ibiTreat （ibidi）
· Accutase (PAA Laboratories GmbH)
· 1x Phosphate buffered saline (PBS)
3.細(xì)胞培養(yǎng)與材料制在將細(xì)胞接種到玻片之前，按照正常的方法培養(yǎng)細(xì)胞。
µ-Slide VI 0.4：通道玻片和培養(yǎng)基，在37℃和5% Co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。這是必不可少的，以避免氣泡隨著時間的推移出現(xiàn)。為此，在50毫升容器中填充適當(dāng)量的培養(yǎng)基，并將瓶蓋稍微擰緊。在一個開放的形式，如用µ-Slide 8 well，氣泡可以出來到大氣中。
拆下µ-Slide，把它放在一個滑動架上，在準(zhǔn)備細(xì)胞懸浮液的同時將蓋子分別放在 Luer 適配器/孔上
分離細(xì)胞：
吸出培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，并用PBS洗滌細(xì)胞一次。每75cm²燒瓶中加入3-5 ml的Accutase，并將燒瓶放入培養(yǎng)箱中以加快分離速度。如果是RAW-264.7細(xì)胞系，則大約需要8分鐘。使用Accutase分離的細(xì)胞存活率更高。
4.1. 將細(xì)胞接種到µ-Slide VI0.4中
µ-Slide VI0.4的推薦細(xì)胞濃度：對于最終的細(xì)胞數(shù)為 0.3 x 10 5cells/cm²，準(zhǔn)備 6 x 10 5 cells/ml的濃度。通過移液器吸頭把30 µl細(xì)胞懸浮液填充到每個通道中。將蓋子蓋在玻片上，在37°C和5％CO2下孵育半小時以固定細(xì)胞。
細(xì)胞附著后，分別用60 µl無細(xì)胞培養(yǎng)基填充儲槽。避免將移液器吸頭直接指向通道的入口。將玻片放回培養(yǎng)箱中。
圖1：接種后一小時，在ibiTreat µ-Slide VI0.4(貨號80606）中的RAW-264.7。
圖2: 在ibiTreat µ-Slide VI0.4中孵育24小時后的RAW-264.7
圖3:在ibiTreat µ-Slide VI0.4中的RAW-264.7，培養(yǎng)四天后。
4.2 將細(xì)胞播種在µ-Slide 8 well 中
在µ-Slide 8 well建議的細(xì)胞濃度：最終細(xì)胞數(shù) 0.3 x 10 5 cells/cm² ，制備濃度 1.1 x 10 5 cells/ml。將300 µl 的細(xì)胞懸浮液注入各孔中。將蓋子蓋在玻片上，在37°C和5% Co2中孵育。不需要進(jìn)一步添加培養(yǎng)基。
圖4：在ibiTreat µ-Slide 8 well（貨號80826）中的RAW-264.7，播種后1小時。
圖5: 在ibiTreat µ-Slide 8 well中的RAW-264.7，孵育24小時后。
圖6：在ibiTreat µ-Slide 8 well中的RAW-264.7，經(jīng)過四天的培養(yǎng)
對于一個最佳的均勻細(xì)胞分布，我們建議使用通道µ-Slide VI 0.4。在8孔腔室載玻片中，取決于在細(xì)胞播種過程中的處理，細(xì)胞密度的整個表面上因點而異。
5.免疫熒光染色
像往常一樣為您的細(xì)胞固定和染色。
下面，用下列材料對細(xì)胞核和肌動蛋白絲染色進(jìn)行一個例子：
細(xì)胞核：DAPI（Diamidino pheylindol dihydrochlorid） SIGMA, 32670
肌動蛋白絲：Phalloidin, Alexa Fluor ® 488 Conjugate, LONZA, PA-3010
1. 用3.7% 的PFA在PBS（pH 7.4）中室溫下固定細(xì)胞10分鐘。
2. 用PBS清洗細(xì)胞三次。
3. 用Triton X 100（0.1%）孵育細(xì)胞5分鐘。
4. 用PBS清洗細(xì)胞三次。
5. 用1%牛血清白蛋白在PBS中孵育20分鐘。
6. 用PBS清洗細(xì)胞三次。
7. 在0.2μm濃度下用鬼筆環(huán)肽Alexa For 488孵育細(xì)胞20分鐘。
8. 用PBS清洗細(xì)胞三次。
9. 用DAPI（0.5μg/ml）孵育細(xì)胞10分鐘。
10. 用PBS清洗細(xì)胞三次。
11.完全吸出通道液體，并用ibidi封片劑重新填充，樣品現(xiàn)在可以在顯微鏡下觀察了，在陰暗陰涼處可儲存數(shù)周。
圖7：在 µ-Slide VI0.4中的RAW-264.7用DAPI（細(xì)胞核、藍(lán)色）和Phalloidin, Alexa Fluor ® 488 Conjugate（肌動蛋白絲，綠色）
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