文獻解讀：儲軍課題組開發(fā)出新型高性能基因編碼的cAMP熒光探針
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文獻精讀第34期
深圳先進院儲軍研究員為該論文的通訊作者，深圳先進院助理研究員王亮博士及北京大學(xué)鄔春靈博士為該論文的共同第/一作者。該工作得到了北京大學(xué)李毓龍課題組、中國科學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所徐敏課題組和何杰課題組、中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院陳守登課題組、美國堪薩斯州立大學(xué)Ho Leung Ng課題組、中國科學(xué)院深圳先進技術(shù)研究院路中華課題組和鄭煒課題組及華中科技大學(xué)高尚邦課題組等多個合作伙伴的大力支持。
為了開發(fā)適用于活體檢測的高靈敏度探針，研究人員將環(huán)化重排綠色熒光蛋白(cpGFP)插入細菌MlotiK1通道的cAMP結(jié)合結(jié)構(gòu)域(mlCNBD)中。經(jīng)過插入位點篩選、連接肽優(yōu)化、熒光蛋白及感應(yīng)模塊優(yōu)化，得到了具有高亮度、高靈敏度、合適親和力和快響應(yīng)速度等特征的高性能基因編碼cAMP綠色熒光探針G-Flamp1。非常有意思的是，晶體結(jié)構(gòu)顯示G-Flamp1探針的連接肽具有獨一/無二的結(jié)構(gòu)：其中一個連接肽是一個非常剛性的 β-strand 結(jié)構(gòu)，這在其它晶體結(jié)構(gòu)已知的環(huán)化重排熒光蛋白探針中是不存在的，為開發(fā)其它高性能探針提供了新思路和新方法。
在體外實驗中，結(jié)合/未結(jié)合cAMP的G-Flamp1有不同發(fā)色團環(huán)境。G-Flamp1在450nm(單光子)或者900-920nm(雙光子)激發(fā)下，動態(tài)范圍達最大，即ΔF/F0約為13。G-Flamp1與cAMP親和力適中，其解離常數(shù)Kd值為2.17µM。G-Flamp1可在亞秒時間分辨率上檢測cAMP動態(tài)變化。在培養(yǎng)細胞中，該探針均勻分布在細胞質(zhì)和細胞核中，本底熒光亮度介于同類探針cAMPr和Flamindo2之間。G-Flamp1探針在活細胞中的動態(tài)范圍達到了12倍，是目前少數(shù)幾個動態(tài)范圍在10倍以上的熒光蛋白探針之一。同時該探針具有良好的特異性和可逆性(圖1)。
圖1 G-Flamp1探針在體外和培養(yǎng)細胞內(nèi)的表征
隨后，研究人員將G-Flamp1探針應(yīng)用于果蠅這一模式生物中。果蠅腦部蘑菇體(mushroom body)的Kenyon細胞中cAMP信號通路在氣味相關(guān)的記憶中發(fā)揮關(guān)鍵作用。作者首先獲取了Kenyon細胞中表達G-Flamp1探針的轉(zhuǎn)基因果蠅，然后利用雙光子進行成像，果蠅受到氣味或電擊刺激時，蘑菇體不同子區(qū)域呈現(xiàn)不一樣的cAMP信號時空變化(圖2)，暗示不同子區(qū)域可能在聯(lián)想性學(xué)習(xí)中起著相對獨立的作用。
圖2 不同刺激下果蠅Kenyon細胞中cAMP信號的變化
為驗證G-Flamp1探針在活體動物中檢測cAMP動態(tài)變化的實用性，研究人員利用腺相關(guān)病毒在小鼠運動皮層中共表達綠色G-Flamp1探針和紅色jRGECO1a鈣探針�；铙w雙光子成像揭示了跑步運動中細胞特異性的cAMP信號，其與鈣信號無明顯相關(guān)性(圖3)。這反映了小鼠運動時大腦皮層M1神經(jīng)元反應(yīng)的異質(zhì)性。
圖3 運動過程中小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元內(nèi)cAMP信號的變化
最后，研究人員在小鼠大腦深部的伏隔核（NAc）腦區(qū)中表達G-Flamp1探針，并利用光纖記錄聽覺巴甫洛夫條件反射任務(wù)中該腦區(qū)cAMP信號的變化。結(jié)果表明，隨著訓(xùn)練的熟練，小鼠得到獎賞時cAMP信號幅度在降低，而聽到相應(yīng)聲頻信號時cAMP信號幅度在升高(圖4)；該特性與多巴胺信號類似，暗示多巴胺釋放引起了cAMP信號。綜上，G-Flamp1探針的高信噪比和高時間分辨率能夠高靈敏檢測到活體小鼠中內(nèi)源性cAMP信號的動態(tài)變化。
圖4 巴甫洛夫條件反射任務(wù)中小鼠NAc腦區(qū)cAMP信號的變化
綜上所述，該研究開發(fā)了一種適用于活體檢測的cAMP熒光探針，并初步揭示了果蠅和小鼠等模式生物在特定行為過程中特定神經(jīng)元的cAMP信號變化的規(guī)律，為進一步理解cAMP信號的調(diào)控和功能奠定了基礎(chǔ)。與廣泛使用的鈣離子探針GCaMP相比，G-Flamp1才僅僅只是開始：目前已有幾十家國內(nèi)外實驗室在使用G-Flamp1，未來將會有更多實驗室利用G-Flamp1來研究復(fù)雜的生物學(xué)問題。
在未來研究中，研究人員將進一步提高探針性能，開發(fā)適用于不同應(yīng)用場景的下一代高靈敏cAMP探針，并利用其揭示活細胞和活體中cAMP信號的規(guī)律、調(diào)控機制及生物學(xué)功能。與此同時，結(jié)合高內(nèi)涵藥物篩選平臺，上述探針也將嘗試應(yīng)用于針對GPCR受體的藥物篩選，以期發(fā)現(xiàn)更多的具有臨床價值的GPCR藥物。
儲軍，研究員，博士生導(dǎo)師。中國科學(xué)院百人計劃A類。廣東省生物醫(yī)學(xué)光學(xué)影像技術(shù)重點實驗室副主任。2001年獲華中科技大學(xué)生物技術(shù)專業(yè)學(xué)士學(xué)位；2004年獲華中科技大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程專業(yè)碩士學(xué)位；2009年獲得華中科技大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程專業(yè)博士學(xué)位，2009-2015年分別在麻省大學(xué)阿莫斯特分校和斯坦福大學(xué)進行博士后研究。2015年加入中科院深圳先進技術(shù)研究院。研究方向為新型光學(xué)和光聲分子探針的開發(fā)、分子信號通路的光學(xué)成像和光遺傳學(xué)、分子診斷和藥物篩選等研究等。目前已主持2項國家自然科學(xué)基金面上項目、主持和參與2項國家重點研發(fā)計劃，并主持多項深圳市項目，在Nature Biotechnology、Nature Methods、Nature Communications、PNAS等國際知名雜志發(fā)表論文30余篇。申請15項發(fā)明專利，并授權(quán)7項。
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