助力分子生物學(xué)研究的數(shù)字PCR技術(shù)介紹與應(yīng)用

瀏覽次數(shù)：1747　發(fā)布日期：2022-10-20　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

　分子生物學(xué)作為一門新興的邊緣學(xué)科，它的迅速發(fā)展及其在整個生命科學(xué)領(lǐng)域的廣泛滲透和應(yīng)用，促使人們對生物體的認(rèn)知已經(jīng)逐漸深入到微觀水平。從單個的生物體到器官、組織、細(xì)胞，再從細(xì)胞結(jié)構(gòu)到核酸和蛋白的分子水平，人們意識到可以通過檢測分子水平的線性結(jié)構(gòu)(如核酸序列)，來橫向比較不同物種，同物種不同個體，同個體不同細(xì)胞或不同生理狀態(tài)的差異。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，分子生物學(xué)為醫(yī)學(xué)診斷、治療及新的疫苗、新藥物研制等開辟了新的途徑，使醫(yī)學(xué)科學(xué)中原有的學(xué)科發(fā)生分化組合，醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)等新的學(xué)科分支不斷產(chǎn)生，使醫(yī)學(xué)科學(xué)發(fā)生了深刻變革。

　　分子生物學(xué)技術(shù)問世于20世紀(jì)80年代中期。這種以核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子為研究對象的新技術(shù)自發(fā)現(xiàn)以來，已經(jīng)逐步成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域不可或缺的研究手段之一，利用分子生物學(xué)技術(shù)研究人體內(nèi)源性或外源性生物分子的存在、結(jié)構(gòu)或表達(dá)調(diào)控變化，為疾病研究以及進(jìn)一步的預(yù)防、預(yù)測、診斷、治療、預(yù)后和轉(zhuǎn)歸提供信息和決策依據(jù)。其中，在精準(zhǔn)醫(yī)療以及新冠肺炎疫情全球蔓延的大背景下，分子診斷學(xué)技術(shù)得到了近一步應(yīng)用，也為分子生物學(xué)發(fā)展提供了新的機(jī)遇。

　　目前常見的分子診斷技術(shù)主要為熒光定量PCR技術(shù)(qPCR)、高通量測序技術(shù)(NGS)，數(shù)字PCR (digital PCR, dPCR) 是繼一代普通PCR、二代熒光定量PCR之后的第三代PCR技術(shù)，其具有高敏感度、絕對定量、高特異性、使用標(biāo)本用量少等特點，在科研領(lǐng)域迅速得到廣泛應(yīng)用，是科研領(lǐng)域新一研究利器!

　　在定量PCR時，我們常常糾結(jié)一個問題，究竟是相對定量還是絕對定量呢?現(xiàn)在我們再也不需要去糾結(jié)這個問題了，因為數(shù)字PCR幫我們解決了。

　　數(shù)字PCR技術(shù)介紹

　　數(shù)字PCR是一種核酸分子絕對定量技術(shù)。當(dāng)前核酸分子的定量有三種方法，其中，光度法基于核酸分子的吸光度來定量，實時熒光定量PCR(Real Time PCR)基于Ct值(可以檢測到熒光值對應(yīng)的循環(huán)數(shù))，數(shù)字PCR是全新的定量技術(shù)，基于單分子PCR方法來定量核酸，是一種絕對定量的方法。主要采用當(dāng)前分析化學(xué)熱門研究領(lǐng)域的微流控或微滴化的方法，將大量稀釋后的核酸溶液分散至芯片內(nèi)數(shù)萬個微反應(yīng)器或微滴中，每個反應(yīng)器包含或不包含一個或多個拷貝的目標(biāo)分子，從而實現(xiàn)”單分子模板PCR擴(kuò)增”，擴(kuò)增結(jié)束后含有核酸分子模板的微滴會給出熒光信號，最終根據(jù)泊松分布原理以及陽性微滴的比例，通過分析軟件計算給出目的分子的濃度或拷貝數(shù)。

　　數(shù)字PCR可以直接計算目標(biāo)序列的拷貝數(shù)，因此無需依賴于對照樣品和標(biāo)準(zhǔn)曲線就可以進(jìn)行精確的絕對定量檢測;此外，由于數(shù)字PCR在進(jìn)行結(jié)果判讀時僅需判斷有/無兩種擴(kuò)增狀態(tài)，因此也不需要檢測熒光信號與設(shè)定閾值線的交點，完全不依賴于Ct值的鑒定，因此數(shù)字PCR的反應(yīng)受擴(kuò)增效率的影響大大降低，對PCR反應(yīng)抑制物的耐受能力大大提高;數(shù)字PCR實驗中標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系分配的過程可以極大程度上降低與目標(biāo)序列有競爭性作用的背景序列濃度。

　　那么，數(shù)字PCR可以幫助我們解決哪些科研難題呢?

　　數(shù)字PCR助力基礎(chǔ)科研

　　(1)基因表達(dá)差異研究

　　基因的差異化表達(dá)由多種因素共同導(dǎo)致，并且與許多疾病的發(fā)生和發(fā)展有密切聯(lián)系，對差異化表達(dá)的基因進(jìn)行生物信息學(xué)以及生物統(tǒng)計學(xué)的分析對于研究細(xì)胞調(diào)節(jié)機(jī)制和疾病機(jī)理有著重要意義。

　　實時熒光定量PCR 常用于檢測基因表達(dá)差異，但該方法一般只能檢測出兩倍或者更大的差異。而多數(shù)科學(xué)研究則需要檢測更為微小的表達(dá)變化。數(shù)字PCR由于檢測時完全不依賴傳統(tǒng)的Ct值即可實現(xiàn)真正意義上的絕對定量，從而提供了比實時熒光定量PCR更精確的基因差異表達(dá)研究，尤其對于那些靶基因表達(dá)差異微小的情況：microRNA、lncRNAs等的表達(dá)分析、等位基因的不平衡表達(dá)、單細(xì)胞基因表達(dá)分析、Exosome內(nèi)核酸分子定量分析等。

　　(2)拷貝數(shù)(CNV)研究

　　CNV，即拷貝數(shù)變異(Copy number variation, CNV)，是由基因組發(fā)生重排而導(dǎo)致的，一般指長度為 1 kb 以上的基因組大片段的拷貝數(shù)增加或者減少，主要表現(xiàn)為亞顯微水平的缺失和重復(fù)。CNV對于物種特異的基因組構(gòu)成、物種的演化和系統(tǒng)發(fā)育以及基因組某些特定區(qū)域基因的表達(dá)和調(diào)控可能具有非常重要的生物學(xué)意義。

　　通�？截悢�(shù)分析依賴于瓊脂糖凝膠電泳、實時熒光定量PCR 等方法，但該種方法拷貝數(shù)的確定總是受到限制。其中，傳統(tǒng)實時熒光定量PCR平臺可以鑒別低拷貝數(shù) (如0至5的拷貝數(shù))，但更高的拷貝數(shù)需要更精確的測量。dPCR通過直接計數(shù)目標(biāo)基因和參照基因的雙重反應(yīng)，通過計算比值，可直接得到目標(biāo)基因的拷貝數(shù)，適用于更高拷貝數(shù)分析，檢測精度超過±10%。

　　(3)低豐度DNA模板分子的精確定量

　　目前對于低豐度目標(biāo)序列的檢測，定量PCR、雜交、毛細(xì)管測序及NGS等方法都因受到背景DNA的干擾，使得檢測靈敏度及精確性都達(dá)不到精細(xì)定量的要求(如定量PCR檢測中Ct值大于33的情況下，其重復(fù)性就不是很高)，而數(shù)字PCR系統(tǒng)通過稀釋樣品DNA到對應(yīng)的數(shù)萬個檢測孔中，使得稀有的核酸序列從大量的背景DNA中分離出來，從而提高了檢測的靈敏度及重復(fù)性。此外，也將樣品中可能存在的抑制劑進(jìn)行了分裝，提高了數(shù)字PCR擴(kuò)增對于抑制劑的耐受程度，因此可具體應(yīng)用于很多臨床樣品(血液、尿液、糞便、痰液、腦脊液等)中對腫瘤核酸標(biāo)記物的檢測。一般而言，毛細(xì)管電泳和定量PCR的檢測靈敏度約在10%;NGS的靈敏度可達(dá)到1%;而ddPCR的檢測下限為0.001%，適用于低豐度DNA模板分子的精確定量。

　　(4)甲基化含量鑒定

　　作為表觀遺傳學(xué)研究中重要的一個研究方向——甲基化程度分析，現(xiàn)階段有不同的方法或技術(shù)來進(jìn)行研究：如傳統(tǒng)的亞硫酸氫鹽處理后的克隆測序統(tǒng)計法、抗體檢測法、定量PCR檢測法等。這些方法皆因方法學(xué)的問題而不能獲得精確的定量，而數(shù)字PCR系統(tǒng)通過對樣品的微滴化處理及目標(biāo)因子的絕對拷貝數(shù)定量，為甲基化程度的精確定量檢測提供了一種全新的技術(shù)。

　　Dawne N1等人使用數(shù)字PCR進(jìn)行DNA甲基化的檢測。結(jié)果顯示，數(shù)字PCR方法可檢出低至0.5%的SNRPN啟動子甲基化，其線性R2可達(dá)到0.9903，且將ddPCR結(jié)果與NGS檢測結(jié)果對比，一致性強(qiáng)，所用DNA量更少。Liesbeth Van Wesenbeeck2等人使用ddPCR和qPCR做DNA甲基化線性檢測時，對比結(jié)果顯示，在檢測低拷貝DNA時，ddPCR準(zhǔn)確性較qPCR更高。

　　(5)CRISPR-Cas9基因編輯結(jié)果驗證

　　CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)，規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列，是一種RNA引導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)，能對基因進(jìn)行精確性敲除、敲入、替換等，從而實現(xiàn)探究基因功能,修復(fù)致病基因等目的。但是，CRISPR技術(shù)也會導(dǎo)致有潛在危險的“脫靶”問題，帶來不可預(yù)測的基因變化，因此對于CRISPR基因編輯的脫靶情況需要靈敏且精準(zhǔn)的驗證及檢測。

　　目前有幾種方法可供選擇，其中新一代測序技術(shù)當(dāng)然是金標(biāo)準(zhǔn)，但對于許多實驗室而言仍然是高不可攀的，對于小型項目來說也是不切實際的。數(shù)字PCR技術(shù)可以滿足這一需求。歐洲分子生物學(xué)實驗室研究人員Moritz Kueblbeck開發(fā)了一種聯(lián)合熒光標(biāo)記蛋白和數(shù)字PCR的新方法，精準(zhǔn)快速地實現(xiàn)了對基因編輯后的目的基因篩選，該方法大大地降低了檢測的人力、物力和成本。

　　展望

　　總而言之，由于數(shù)字PCR具有比傳統(tǒng)qPCR更加出色的靈敏度和特異性、精確性，目前已迅速得到廣泛的應(yīng)用研究，其中這項技術(shù)在極微量核酸樣本檢測、復(fù)雜背景下稀有突變檢測和表達(dá)量微小差異鑒定方面變現(xiàn)出的優(yōu)勢已被普遍認(rèn)可，而在基因表達(dá)研究、拷貝數(shù)鑒定、甲基化含量鑒定、NGS測序文庫精確定量和結(jié)果驗證等諸多方面具有的廣闊應(yīng)用前景已經(jīng)受到越來越多的關(guān)注。

　　但截止目前而言，數(shù)字PCR對廣大科研工作者仍然是一種全新的檢測方法，我們在看待數(shù)字PCR的應(yīng)用前景時，更應(yīng)該保持一種開放的心態(tài)，與其說數(shù)字PCR技術(shù)是一個新的研究利器，不如把它視為一種全新的技術(shù)思路和手段，在這個平臺上必將有更多的應(yīng)用幫助我們深入到分子生物學(xué)研究的更高層次。

　　參考文獻(xiàn)：

　　Dawne Shelton, et al. “AACR 2014 - Cross Validation of NGS methylated targets using ddPCR”.

　　Liesbeth Van Wesenbeeck, et al. “Droplt digital PCR is an accurate method to assess methylation status on FFPE samples”. Epigenetics. 2018; 13 (3): 207–213.

　　焱伯?dāng)?shù)字PCR平臺助力科學(xué)研究

　　焱伯?dāng)?shù)字PCR采用MEMS工藝打造的納米級微流控芯片，可將樣本通過芯片微流道分散到數(shù)萬個反應(yīng)單元中，對每個反應(yīng)單元進(jìn)行獨立的擴(kuò)增與熒光信號的檢測，對反應(yīng)體系中的靶標(biāo)進(jìn)行絕對定量。同時，焱伯?dāng)?shù)字PCR平臺秉持精密小巧工具化理念，讓更多科研用戶能在日常工作情境中輕松試用，使它成為有效的檢測工具。